多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定

多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法

（一）

试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。

2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。

贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。

贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）

5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）

方法：

1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。

2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。

3、结果计算：A多酚=0.44{[⑥-(④+⑤)/2]-[③-(①+②)/2]}*V1/V2/W/t

V1：提取时酶液总量（毫升）V2：测定时酶液用量（毫升）

①、②、③、④、⑤、⑥：测定时消耗碘液量（毫升） t：酶反应时间（分）

2 4 2 2 同上

3 4 2 2 1 空白测定

4 4 2 1 2 测多酚氧化酶

5 4 2 1 2 同上

6 4 2 1 2 1 空白测定

分光光度计法测定多酚氧化酶（二）

试剂：

①0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22g焦儿茶酚溶于100ml蒸馏水中，现用现配。

②pH6.0磷酸缓冲液：87.7ml A+12.3ml B,用蒸馏水稀释至200ml。

储备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6gNaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。

储备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65gNa2HPO4·7H2O或

71.7gNa2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000ml）。

③10%偏磷酸：称1g偏磷酸溶于100ml蒸馏水中。

方法：

1．称取新鲜样品1g，剪碎，置于研钵中，加入少量的磷酸缓冲液，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用磷酸缓冲液定容25ml于离心管中。在30度下静置30分钟，中间摇动3-4次；放入离心机于4000r/min离心20分钟。其上清液即为粗酶提取液。

2．取干洁试管3支（编号），分别加入4ml蒸馏水，1ml焦儿茶酚，其中一支作为对照，在加入酶液之前加入1ml偏磷酸以终止酶活性。然后每隔1分钟向各试管依次加入酶液1ml，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然依次间隔1分钟向（除对照外）试管中加入1ml偏磷酸，用于终止酶活性。（反应时间为10min）3．最后在420nm处比色，记录吸光度。

4．活性计算：以单位质量烟叶每分钟内OD420值变化0.01为一个酶活力单位，按下式计算

多酚氧化酶的活性（0.01OD420/g.min）=OD420*D/0.01t*W