植物遗传转化(PPT-70)
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第九章 植物基因的遗传转化
T-DNA区：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上 切割下来转移到植物细胞的一段DNA，又称转移 DNA；该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 Vir区：该区段的基因能激活T-DNA转移，时农杆 菌表现除毒性，又称毒区。 Con区：该区段上存在着与细菌间结合转移的有关 基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。 Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，又称 复制起始区。
三）步骤
1）微粒体的洗涤； 2）DNA微弹载体的制备； 原理是CaCl2对DNA沉淀作用，亚精胺、聚乙二醇 具有黏附作用，将这些化合物与DNA混合后与金 （钨）粉混合，吹干后，则DNA沉淀在载体颗粒上。 3）靶外植体材料的准备； 4）DNA微弹轰击； 5）轰击后外植体的培养。
四）转化率及影响因素
质粒DNA的提取（可以是Ti质粒，也可直接提取某 一植物的DNA作目的基因）； 原生质体的分离； 转化培养：将新制备的原生质体悬浮液与质粒DNA 保温培养，同时加入PEG，在PH8－9下促进原生质 体摄取DNA，使细胞转化；转化培养同时加入运载 DNA，即鲑鱼精DNA促进转化； 离心收集原生质体； 将原生质体按一般方法培养，当细胞团长到一定大 小时，将细胞团转移至含选择压力的培养基种筛选 转化细胞。
二）电击法介导基因转化
物理方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或 通过机械损失直接将外源DNA导入细胞。可以原生 质体为受体，也可直接以植物细胞乃至组织、器官 为受体，比化学法更具广泛性和实用性。 1985年李宝健等首先将电击法用于植物细胞的基因 转化，该法在禾谷类作物种更有发展潜力。 原理：利用高压电脉冲作用在原生质体膜上电击穿 孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄 取。
植物遗传转化
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。
8 园艺植物遗传转化PPT课件
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞
作为靶材料。 操作简便。 常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基
21
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点： 1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体
3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成
期）的细胞才具有被转化的能力，这个 时期称为“转化的敏感期”。
能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
31
第二节 转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点
1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。
2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞
作为靶材料。 操作简便。 常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基
21
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点： 1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节 转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体
3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成
期）的细胞才具有被转化的能力，这个 时期称为“转化的敏感期”。
能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
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第二节 转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点
1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。
2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
植物细胞的遗传转化ppt(共73张PPT)
生根壮苗
其它方法
植物病毒感染法
花粉管通道法
电穿孔转化法 激光微束穿孔转化法
显微注射法
超声波介导转化法
多聚物介导法
浸渍法
电泳法 碳化硅纤维介导法
真空渗透法 圆球体法 等等
1.3 转基因植物的鉴定
遗传表型特征筛选 依赖于重组子结构特征分析筛选 核酸分子杂交分析 免疫化学分析检测 PCR筛选法
3.1 遗传表型特征筛选 常用的报告基因
种质资源的重要性
• 种质资源是在漫长的历史过程中, 由自然演化和人工创 造而形成的一种重要的自然资源。
• 积累了由于自然和人工引起的极其丰富的遗传变异,即
蕴藏着各种性状的遗传基因。
• 人类用以选育新品种和发展农业生产的物质基础, • 也是进行生物学研究的重要材料, 是极其宝贵的自然
财富。
• 种质保存(germplasm conservation) ： 利用天 然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的 遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力，能 通过繁殖将其遗传特性传递下去。
拿大和中国。这四个国家种植了全世界 99% 的转基因作物。
• 目前，我国共批准发放7种转基因作物安全证书，分别是耐储 存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木 瓜、转植酸酶玉米和抗虫水稻。
• 大规模商业化生产的只有抗虫棉和抗病毒木瓜。 • 进口用作加工原料的转基因作物有大豆、玉米、棉花、油菜和
通过繁殖将其遗传特性传递下去。
分化出苗
生根壮苗
包括品种、类型、近缘种和野生种的植株、种子、无性繁殖器宫、花粉甚至单个细胞，只要具有种质并能繁殖的生物体，都能归入种质资源
之内。
这四个国家种植了全世界 99% 的转基因作物。
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 在农杆菌侵染外植体前进行预培 养可以减轻伤害胁迫，调整细胞状 态。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
植物基因转化PPT课件
C、双元载体 • 利用两个载体分别提供T-DAN区域（卸甲的）和毒性功能
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
第21页/共29页
四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
第23页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
第5页/共29页
根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
第6页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
第11页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
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克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由 农杆菌完成目的基因向植物基 因组的转移
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四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化 （二）基因枪 （三）整株植物转化 （四）叶绿体转化
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根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒 一个中间载体（intermediate vector）组成 （一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适 的T-DNA片断，而构成的小型质粒 ）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
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根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
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根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
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根癌农杆菌介导的遗传转化
十章园艺植物遗传转化1ppt课件
为了抑制农杆菌的过度生长而产生污染，选择、 筛选转化的细胞核植株，在遗传转化中常使用两类 抗生素： 1）选择性抗生素：在遗传转化中用于筛选转化体，如 卡那霉素、潮霉素 2）抑菌性抗生素：在受体材料与农杆菌共培养一定时 间后用于抑制农杆菌的生长 ，防止细菌过度生长而 产生污染。这类抗生素要求对植物细胞无毒害作用 或毒害作用较小，不影响植物细胞的正常生长，如 氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素等
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
第二节 园艺植物遗传转化方法
一、外源裸露DNA的转化
（一）化学诱导转化法
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定 的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。
目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟 氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。
第二节 园艺植物遗传转化方法
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
（2）原生质体受体系统
原生质体转化受体系统的优点： a）原生质体无细胞壁，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传 物质 b）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克 隆，无嵌合性愈伤组织，由其再生的转基因植株无嵌合性 c）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制 条件下进行准确的转化和嵌合 d）适用于各种转化系统
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(5)对农杆菌侵染的敏感性
1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的 天然寄主，否则难以实现遗传转化
2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但 其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植 物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织 细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统 对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作 为受体系统
第12章 植物遗传转化
其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。
2、Ti质粒的基因位点及其功能区域
LB RB
❖ Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右） （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）: T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并
整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。 （2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒
来源不同可分成有4类： ①细菌质粒（plasmid）：大肠杆菌质粒，农杆菌质粒 ②噬菌体类：包括λ噬菌体衍生物、M13噬菌体、柯斯质粒 ③酵母的质粒： ④病毒DNA的衍生物等。
按功能及构建过程，又可把有关载体分为四大类型
植物基因 工程载体
克隆载体
中间载体
中间克隆载体
中间表达载体
•onc卸甲载体
•Onc+
•一元转化载体（共整合载体和拼接末端载体） 转化载体 •双元转化载体
❖ 克隆载体：用于保存和克隆目的基因。 ❖ 中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体，前者是由大肠杆
菌质粒插入了T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是 构建中间表达载体的基础质粒。后者是含有植物特异启动子的中 间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。
因此，常常需要利用特定的运载工具，把外源DNA片段送入受 体细胞，我们把携带外源基因进入受体细胞的这种运载工具叫做载 体（vector）。
载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连和导入受体细 胞，还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中得到复制或 表达。
一、植物基因工程载体种类
2、Ti质粒的基因位点及其功能区域
LB RB
❖ Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右） （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）: T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并
整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。 （2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒
来源不同可分成有4类： ①细菌质粒（plasmid）：大肠杆菌质粒，农杆菌质粒 ②噬菌体类：包括λ噬菌体衍生物、M13噬菌体、柯斯质粒 ③酵母的质粒： ④病毒DNA的衍生物等。
按功能及构建过程，又可把有关载体分为四大类型
植物基因 工程载体
克隆载体
中间载体
中间克隆载体
中间表达载体
•onc卸甲载体
•Onc+
•一元转化载体（共整合载体和拼接末端载体） 转化载体 •双元转化载体
❖ 克隆载体：用于保存和克隆目的基因。 ❖ 中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体，前者是由大肠杆
菌质粒插入了T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是 构建中间表达载体的基础质粒。后者是含有植物特异启动子的中 间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。
因此，常常需要利用特定的运载工具，把外源DNA片段送入受 体细胞，我们把携带外源基因进入受体细胞的这种运载工具叫做载 体（vector）。
载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连和导入受体细 胞，还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中得到复制或 表达。
一、植物基因工程载体种类
植物遗传转化方法和技术PPT课件
第35页/共56页
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
第36页/共56页
到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
第41页/共56页
2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
第42页/共56页
high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
第24页/共56页
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
第5页/共56页
第6页/共56页
一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
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（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
每外植体芽数 Shoots per explant
7 6 5 4 3 2 1 0
品种 variety
1.0mg/L 1.2mg/L 1.5mg/L 1.7mg/L 2.0mg/L
科 丰 6
科 丰 14
冀 豆 12
吉 林 35
铁 丰 29
无 腥 一 号 冀 黄 13
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到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。
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2、操作步骤：
（1）制备DNA微弹； （2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
immature embryos
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high osmotic media prepare calli
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
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3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
• 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
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第6页/共56页
一、根癌农杆菌介导法
• 根癌农杆菌介导法的分子机制 • 农杆菌介导法需要具备的条件 • 农杆菌介导法的基本流程
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（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
植物遗传转化
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
农杆菌介导的过程
（4）优缺点 农杆菌介导法优点：①转化频率较高。
②转移的外源片段较大。 ③整合的外源基因多为单拷贝。 ④整合到植物基因组的外源基因可以定向表达。
农杆菌介导法缺点：①受体植物基因型限制。
②农杆菌是一个生物有机体， 转化受植物材料的影响大。
（三）其他常用的转换方法
（1）植株原位真空渗入法 （2） 聚乙二醇法 （3） 脂质体介导法 （4）电击法 （5）体内注射法 （6）碳化硅纤维介导法
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第三类：种质转化系统法；包括植物原位真空
植物遗传转化(PPT-70)
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.3 胚性愈伤组织
愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转 化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。
芹 菜 胚 性 愈 伤 组 织 用 根 癌 农 杆 菌 C58C1 (pBZ6111) 感 染 后 ， 在 MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素 抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到 芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培 养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。
பைடு நூலகம்
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞
以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、 PEG介导法、电激法和显微注射法等。
小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表 达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培 养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基， 20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0 培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测 GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素 的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代 (董云洲等，1998)。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
植物遗传转化
从1986年首批转基因植物被批准进入田间试验
，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因
植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种 。主要包括延熟番茄 , 抗除草剂的玉米、棉花 、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花和玉米,抗 病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜 , 雄性不育的玉 米和莴苣 , 以及改变油脂特性的油菜和大豆等 。
。
优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体 再生植株并不容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等 现象。
• 花粉管通道法 利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将 外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或 早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 １／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。
转基因块茎中花色苷含量分析
一种基于同源重组构建多基因双元载体的方法张兴国按目的基因导入位置细胞核叶绿体按启动子的类型组成型启动子特异性启动子遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法根癌农杆菌ti质粒转化系统外植体农杆菌共培养芽诱导抗生素筛选生根培养植株再生分子检测转基因植株获得技术特点
整合后外源基因结构变异小
操作简便等优点
该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核 酸分子引入受体细胞，外 源基因进入受体细胞核后 整合到染色体组，然后通 过组织培养再生出完整个 体(植株)。
植物细胞转基因技术幻灯片PPT
基因枪法最早是由美国康 奈尔大学的Sanford最先提出 的。它通过高速飞行的金属颗 粒将包被其外的目的基因直接 导入到受体细胞内，最后整合 到植物基因组并得以表达从而 实现基因转化的方法。1992 年，世界首例转基因小鼠就是 通过该法获得的。
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
射击植物
优点： 抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。 实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点： 进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时 更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
射击植物
优点： 抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。 实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点： 进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时 更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG
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8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.2 悬浮细胞
以悬浮细胞作受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、 PEG介导法、电激法和显微注射法等。
小麦幼胚悬浮细胞用JQ-700基因枪法转化，得到了GUS基因瞬间表 达的各项最适参数。他们还建立了‘冀谷11号’谷子幼穗的悬浮培 养细胞系及植株再生体系。将胚性悬浮细胞系接种到MS培养基， 20d继代1次，直至出现绿芽点；然后转入无激素的MS0或1/2 MS0 培养基分化植株。以基因枪轰击转化悬浮细胞后，放置48h，检测 GUS短暂表达频率TTF％为20％-40%；在添加200mg/L卡那霉素 的MS培养基上，有5％-10％的愈伤组织具有抗性，且能稳定传代 (董云洲等，1998)。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
经过十多年来得探索，基因转化的技术日臻成熟，已经形成了以农杆 菌载体转化和基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。这两种 转化系统机理清楚、证据确凿，成功的例子最多，约占已获转基因植物 的90%以上 。
8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
学习后的感受：
1.植物遗传转化受体？ 2.植物遗传转化方法？ 3.转基因植株的再生？ 4.转基因植株的检测？
8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
教学目的与要求
了解植物遗传转化的受体，以及植物遗传转化的方法与原理。
自1983年第一个转基因植物问世以来只有20多年的时间，但植物基因 工程的发展日新月异，硕果累累。将外源基因人为导入天然植物中，从 遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状 将按着有利于人们需要的方向发生改变。植物基因工程具有得天独厚的 优势是植物细胞的“全能性”理论。这是动物细胞所不能比拟的，其次 是植物基因工程不会像动物或人类基因工程那样遇到较多的社会、伦理、 道德等问题。植物基因工程为育种开辟了一条崭新的途径。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.1 原生质体
原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体是 单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。
水稻广亲和品种‘02428’的原生质体用聚乙二醇(PEG)法导入具 有潮霉素B(HPT)抗性基因、卡那霉素抗性基因(KanR)和昆虫荧光 素酶基因(Luc)的质粒 pTHL27DNA，在含有25μg/ml潮霉素B和 100μg/ml卡那霉素的培养基KPR和N6上连续培养处理4周，可以 很好地除去非转化的敏感的原生细胞；然后在无抗菌素选择压力的 培养基中，转化细胞可再生植株(杨歧生等， 1996)。
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8.1 植物基因转化的受体
植物基因工程中，我们把接受外源(目的)基因的生命 体系称为“受体”。尽管接受外源基因的受体包括叶圆 片(盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原 生质体等不同的形态，但其基本形态还是细胞。其中， 叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织 的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达 的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.5 叶圆片
叶圆片(叶盘)是农杆菌转化的主要受体。采取新鲜植 株 上 无 菌 的 幼 嫩 叶 片 ， 用 打 孔 器 或 解 剖 刀 切 取 直 径 35mm 的 叶 圆 片 ， 在 液 体 培 养 瓶 中 与 农 杆 菌 共 培 养 2030min，其间轻轻摇动使农杆菌从切口侵入叶片。然后 将共培养后的叶圆片在滤纸上吸干，转移到非选择性培 养基上培养3d，再转入含卡那霉素或羧苄青霉素等抗生 素的选择培养基上培养，诱导植株再生，这样可获得遗 传均一性较高的转基因植株。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.4 胚状体
胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法也同愈 伤组织。
用根癌农杆菌LBA4404介导番木瓜环斑病毒外壳蛋白（PRSV-CP）与 核酸酶（Nuclease）嵌合基因，通过振动共培养法转化番木瓜子叶 型胚状体，在选择培养基上筛选诱导再生转基因植株。NPT II分析 和Southern blot分子杂交结果表明，PRSV- CP- Nuclease嵌合基因 已经整合到番木瓜核基因组中（周鹏等，1995）。
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.5 叶圆片
叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化，马铃薯“东农303’’的叶盘 用含有质粒pPZH1和辅助质粒pGV2260双元载体的根癌农杆菌菌 株C58C1进行转化，在选择培养基上培养30d后，叶盘切口形成抗 性愈伤组织，转化率为4％-38％；经NPT II酶活性分析和DNA分子 杂交证实获得了转基因再生系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.3 胚性愈伤组织
愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的转 化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。
芹 菜 胚 性 愈 伤 组 织 用 根 癌 农 杆 菌 C58C1 (pBZ6111) 感 染 后 ， 在 MS+2,4-D 1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。在筛选到的氯霉素 抗性愈伤组织中检测到胭脂碱合成酶活性，表明外源基因已整合到 芹菜细胞基因组中并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培 养基上增殖，但分化出的再生植株畸形(郑世学等，1996)。