新生鼠海马、皮层神经元原代培养
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。
海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。
对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。
我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
新生大鼠大脑皮层神经元的原代培养
版 社 ， ０ ： ７４ ８ ２ ４４ —６ ． ０ ６
Ｊ ｌ２ １ ， ｏ １， ｏ ０ 圆衄 ｕ ３Ｖ １ １Ｎ ． ｙ０ ． ２
神经 细胞 培养 的影 响［ ． 用医药 杂志 ， ０ ， （） ３５． Ｊ实 ］ ２ ２１ ３： —６ ０ ９ ５
［］ 李 玉 ， 齐琴 ， ４ 但 习杨 彦彬 ． 小 鼠海马 神 经 细胞 培养 及 其 鉴 定 成年 ［］ Ｊ 昆明 医学 院学 报，０１ ２６： —２ ． ２ １， （） ９３ ． ３ ２
用于 治疗结膜炎 、沙眼等 眼部感 染 ，是临床常用 药物。为有效控 制药
备 好 的上述 ６ 菌液 ，再 加入相应 的培养基 ｌＯ Ｌ，按规 定条 件培 养 株 Ｏｍ
３５ ，逐 日 －ｄ 观察 。 ２． ．２菌液组 ２
品的质量 ，保 证 无菌检 查方 法 的科学性 和检 验结 果 的准确性 。根据 Ⅸ 中国药典 ２ １年版 附录无 菌检查 的要 求 ，建立 复方硫酸锌 滴眼 ００ 液 的无菌检查方法 ，并对其进行方法学 验证 。
３ ５ ，逐 日观察 。 ～ｄ 表１ 试验 组 与阳性对 照 哈尔 滨 医 科 大学 附属 第 一 医 院 ，批 号 ：
２ １１２ ，２ １１２ ，２ １１２规格 ：５ Ｌ支 ）。 ００ １３ ００ １４ ００ １５ ｍ／
２ 方 法与 结果
［ ＿ 州 医学 院学报 ， ０ ， （） ３５． Ｊ锦 ］ ２ ３ ４１５ —６ ０ ２ ：
【】 于 丽华 ， ３ 赵书 平 ， 先 成 ， ． 同种 类 血清 对 新生 大 鼠大 脑 皮层 席 等不
复方硫 酸锌 滴眼液无 菌检查方法 的建立
王 瑛 杨 利 红
（ 黑龙江省食 品药 品检验检测所 ，黑龙江 哈尔滨 １０ ０ ） ５ ０ １
原代培养
原代细胞培养步骤(1)、取新生SD大鼠3只，入75%酒精消毒2分钟，断颈取脑。
(2)、将新生鼠脑放入盛有冷的D’Hanks平衡盐溶液的玻璃培养皿内，置冰盘上，于解剖显微镜下仔细剥除脑膜(3)、将分离的海马组织放入另一个盛有冷的D’Hanks溶液的玻璃培养皿内，用眼科剪剪成小碎片，并移入15(4)、向离心管中加入37℃ 0.25%胰酶溶液，每6个海马组织加1ml胰酶消化液，放入37℃培养箱中孵育10-1即可。
900rpm离心2min。
(5)、吸除胰酶消化液，加入等量的37℃种植液以终止消化，置室温10min。
、加入2ml种植液，以抛光的滴管吹打约15次，分散细胞，静置10min（如仍有组织块，应用200目筛网(7)、调整细胞密度，以90-320/mm2的密度种于六孔板内。
置37℃ 5%CO2培养箱中培养。
、24h后全部吸除种植液，更换成Neurobasal + 2% B27培养液培养。
此后每周以此液半量换液2次。
培养8-10天进行下一步实验。
投票1收藏1实验已经开始了，遇到了其他一些新的问题，但在此我想说说我取新生大鼠海马的体会：象有战友说的那样，我刚开始也是成年大鼠上练习的，一切都还比较顺利，但是要取新生1天的大鼠海马是否要困难的多，主要是由于脑组织太嫩了，稍不注意就化成泥了。
1.冻僵老鼠后，用酒精浸泡消毒，然后用PBS液清洗一下，剪下鼠脑。
2.游离脑部皮肤，用眼科剪经枕骨大孔沿矢状缝剪开颅骨，轻轻游离颅骨和脑组织后，在顶骨和顶间骨之间向左右剪开，然后剪掉颅骨，尽可能往两侧剪，使脑组织充分暴露，以便下一步剥离脑皮质和游离海马。
3.用眼科剪分别两侧在大脑皮质中间横向剪开，深约1mm，然后将整个脑置于装有PBS液的培养皿中，要使液体没过脑组织。
用刮针（用缝衣服的针插在一次性筷子里自制的，用针鼻儿那头）沿着刚才的切口轻轻的向后刮除皮质，切忌过深，完全显露出海马后，从两侧游离，使其漂浮于液体中，然后用牙刮匙从连接处将整个海马从脑中分离出来。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良
பைடு நூலகம்
ＫＥ Ｙ ＷＯＲ ］ ｃ】 ，ｃ ｌ ｒｄ ＤＳ ｅＩ Ｈｃ ｅ … ｒｃＩ ｓ ｍ；ｒｔ ｓ ｕ ｖｌ Ｌ ｃ Ｐ ａｓ
神经 细胞原 代 培 养是 研究 神 经 系 统 结 构 、 能 功 以及 病理 、 生理变 化 的重要手 段之 一 ， 现代 医学和 在 神经 科学 中 已被广 泛应 用 。传 统方 法多用 胎 鼠进 行 中枢 神经细胞 培养 ． 由于胎 鼠的胎 龄不 易掌握 ， 但 以 及某些 核团及 功能 区域解 剖部 位 不 易准 确 定 位 ． 因 此 近年 来以新 生 鼠代 替胎 鼠进行 神经 细胞 原代培养 的实 验 日渐 增 多ｕ ， 由于新 生 鼠对培 养 条 件 的 ］ 但 要求较 胎 鼠苛 刻 ， 常致 培 养效 果 不理 想 。ｌ ９ 年 而 ９９ ｌ 月 ～２ ０ ２ ０ ０年 ６ ， 月 稳们 在 以往 培养方 法 的基础 上 对取材 、 消化 、 温度 、 械 操作 等 方 面进 行 了控 制 和 机 改进 ， 获得 了较理 想 的培 养效 果 ， 为进一 步开展 神经
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系统疾病 的病理 、 理 机制 研 究 提 供 了相 对稳 定 的 生
９０ ／ ５ ｇ Ｌ的 ＤＭＥ ， 积 分数 ０ ０ Ｍ 体 ． ５马血 清 ， 氨 酰 谷 胺３ ．， ｍｇ Ｌ 体积 分数 ０ ０ ／ ． １的 Ｎ。青 霉素 每升 １万单 ，
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养20110110
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养一、玻片的准备A．玻片的清洗1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸(HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。
2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。
每10min换水一次，要换20次以上。
晚上置于双蒸水中浸泡过夜。
3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。
洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。
4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。
玻片高温易碎，速度要快。
完成后在紫外下照射1h。
B. 玻片的包被（PDL包被）用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。
1.准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。
2.在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。
盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。
然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。
即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。
3.使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。
4.第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。
将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。
5.第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。
二. 大脑皮层与海马的解剖A. 解剖前的准备1.解剖器械的灭菌解剖前将器械放在铝饭盒中，倒入75%乙醇，并在超净台中放入适量卷纸，打开紫外杀菌1-2hrs。
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养实验材料：18-20天孕鼠一只,细胞培养板若干实验试剂：细胞培养基（DMEM+10%FBS+1%HEPES+0.2%PSA）,FBS,HBSS,胰酶，10ug/ml Poly-D-Lysine，灭菌超纯水实验器械：显微手术器械一套（直镊，弯镊和显微剪各一把），动物手术器械（中号镊子2把，直剪两把），小号细菌培养皿两个，250ml灭菌烧杯两个，灭菌玻璃吸管，胶头，5ml或10ml灭菌EP管实验步骤：1、实验准备：灭菌消毒，将实验所需手术器械浸泡70%酒精30min，高压灭菌超纯水与250ml烧杯。
2、Poly-D-Lysine铺板，铺板时间5-30min，然后灭菌超纯水洗两次。
3、麻醉18-20天孕鼠（10%水合氯醛腹腔注射3-4ml/kg,一般注射1.5ml），取胚胎，置于灭菌烧杯，以薄膜手套封盖，送至细胞房。
4、剪头，取脑，置于盛有HBSS的细菌培养皿。
5、剥离海马及皮质，置于HBSS中。
6、剥去血管，用镊子撕碎，吸至5mlEP管。
7、加HBSS冲洗干净后，加胰酶（胰酶体积视细胞量而定，一般10X胰酶比例为1：10），置37℃ CO2培养箱消化10min（8min）。
8、吸去胰酶，加FBS（约为总体积的20%）终止消化反应1.5-2min。
9、吸去FBS，加HBSS，反复吹打直至细胞分散均匀（无明显团块及组织碎块，以吹至成乳白色混悬液为宜）。
10、吹打均匀后细胞计数。
11、低速离心机800r/min离心10min。
12、吸去上清，加细胞培养基，吹散均匀，种于细胞培养板（一般6孔板种1*106/孔，依此类推，若需转染则适当加大细胞量）。
13、置于CO2培养箱孵育。
神经元培养步骤
神经元培养步骤新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。
临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS液清洗2 次即可使用。
1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。
台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。
用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。
计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。
3-1神经元的免疫细胞化学鉴定Dapi + NF3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。
连续观察10 d, 并拍照记录。
神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。
新生大鼠海马神经元的原代培养方法
维普资讯
３ Ｏ பைடு நூலகம்９
第３ ６卷 第 ５期 ２０ ０２年 １ ０月
哈尔滨医科大学学报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬＯＦＨＡＲ Ｎ 艇 ＤＩ ＢＩ ＣＡＬ ＵＮ ＶＥＲ １ Ｉ ＳＴＹ
Ｖｏ ． ６． １ ３ Ｎｏ． ５ Ｏｃ ． ｔ．
新 生 大 鼠海 马神 经 元 的原 代 培 养 方 法
用膜 片钳全细胞记 录方法观察培养 好的神经元 电生理学 特性 。结果 培养 的神经元胞体清 晰 ， 晕光 明显 ， 达了多 表 种 电／ － ￣ｆ 控和化学 门控离子通道 。 结论 Ｊ 本实验方 法简单 、 可靠 ， 保持 了神经元结 构和功能特性 。
［ 关键词 】 海 马 ； 原代培养方 法 ； 子通道 离 ［ 中图分 类号】 ４１ Ｑ２ ［ 文献标识码 】 Ａ ［ 文章编 号】１ ０ １０（ ０ ） — ３０ ０ ０ — ９５２ ２０ ０９ — ２ ０ ０ ５
ｕ ｅ ａ ｕｎ ｔ ｈ ｒ ｃｅ ｓ ｔ ｒ ｄ ｆ ｃ． ｎ ｃ ａ ａ ｔｒ ． ｎ ｉ ｏ Ｋｅ ｒ ：ｈ ｐ ｏ ａ ｕ ， ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｒ ｔ ｄ，ｏ ｈ ｎ ｌ ｙ ｗｏ ｄｓ ｉ ｐ ｅ ｍｐ ｓ ｐ ｉ ｒ ｕ ｔ ｅ ｍｅｈｏ ｉｎ ｃ ａ ｎｅ ｕ 、
ｔ ｒ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｃ ｌ ｖ ｔｄ ｎ ｕ ｏ ｓ ｗ ｒ ｌａ ｄ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｄ ｆ ｒｎ ｏｔｇ － ａｅ ｄ ｃ ｅ ｃ ｌ ｇ ｔｄ ｉｎ ｕｅ ｓｌ ｓ ｕ ｔ ａｅ ｅ ＿ ｎ ｅ ｃｅ ｒ ａ ｘ ｒｓｅ ｉ ｅ ｔ ｖ ｌ ｅ ｇ ｔｄ ａ ｈ ｍｉａ ａｅ ｏ ｉ ｒ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｃ ａ ｎ ｌ ． ｎ ｌ ｓｏ Ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｗｅ ｉｔ ｄ ｃ ｅ ｅ ｉ ｓ ｌ ｄ ｔ ｓ ｂ ｅ Ｎ ｕ ｏ ｓｋ ｐ ｈ ｏ ｄ ｓ ｕ — ｈ ｎ ｅｓ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ ｈ ｔｏ ｒ ｕ ｅ ｈ ｒ ｓ ｉ ｅ ａ ｕ ｔ ｌ ． ｅ ｒ ｎ ｅ ｔｔｅ ｎ ｍｕ ｔ ｃ ｎ ｏ ｍｐ ｎ ｒ ａ ｒ
小鼠原代神经元提取
小鼠原代神经元提取
1. 背景介绍
小鼠是神经科学研究中常用的实验动物，尤其是小鼠原代神经元是研究神经细胞生长、形态及功能的理想模型。
提取小鼠原代神经元是展开这类研究的重要步骤。
2. 提取方法
2.1 原代神经元分离
将小鼠脑的皮层或海马区取出，用酶消化等方法分离出原代神经元。
其中，较为常用的来源是阿霉素（Ara-C）处理后，剥离出菜花状星形胶质细胞后得到神经元。
2.2 细胞贴附
将原代神经元移植到附着于玻璃片或培养皿的细胞培养基中，使其附着并生长。
2.3 细胞培养
在培养基中加入营养物质，如神经生长因子、谷氨酸等，加速神经元的生长，并使组成更加丰富多彩。
2.4 细胞鉴定
通过标记染色、光镜观察等手段，检测培养出来的细胞是否为神经元。
3. 应用领域
小鼠原代神经元的提取及培养成为研究神经科学和神经元特性的
重要手段。
研究重点主要包括神经元的细胞膜特性、各种信号转导途径、神经元与神经胶质细胞之间的相互作用及神经元发育等问题。
此外，还可运用于药理学研究、癫痫及脑防护药物的开发研究等。
4. 注意事项
提取方法中，对原代神经元的提取、分离及培养有许多细节问题，包括材料选择、酶消化时间调节、培养基添加条件等。
在实验过程中，需要注意操作规范化、洁净化，并遵守实验室安全规范。
新生大鼠海马神经元的改良培养
原 代 细胞 换 成神 经 干 细胞 培 养液 后 ２ ， 成 小 ｄ形 细胞 团 ， ５ 至 ｄ形 成 较大 细胞 球 。将 细胞 球 吹打成 单
细胞 和 小 细 胞 团后 ５ 。 ｄ 细胞 又增 殖形 成 细胞 球 （ 图
ｐｅ ｉ ｎ ， ｃ ｎ ｒｉｓｌ ｔ ｒｉ ｖ ｓｉ ａｉ ｎ ｒｍｅ ｔｗｈｉｈ ｕ ｄｅｌｅ ｕｈｅ ｎ ｅ ｔｇ ｔｏ ． Ｋｅ ｙ ｗｏｒ Ｃｕ ｔ ａ ｉｎ；Ｎｅ ｒ ｌｓｅ ｃ ｌｓ ｄｓ ｌｉ ｔｏ ｖ ｕ ａ ｔ ｍ ｅ ｌ；Ｎｅ ｏ ；Ｒａ ｕｒ ｎ ｔ
某 些 中枢 神经 系统 疾病 ，如脑 卒 中等 常 引起 病 灶 区神 经 元 变性 、 坏死 ， 塞 区形 成 ， 致 患 者运 动 梗 导 障碍 、 失语 、 至痴 呆 。 甚 目前 ， 神经 干 细胞移 植治 疗 为 脑 卒 中等 脑损 伤疾 病 提供 了可 能 ｌ ｌ 经 干 细胞 １ 。神 、 ２
的神 经元 ， 对体 外研 究 神经元 对 不 同刺激 的反应 、 新
药检 测 及 完 成类 似 的细胞 生 物 学任 务 有 重要 意 义 。 同时也 可 为神 经细 胞移植 治疗 提供 种子 细胞 。
泸 州 医学 院学 报
２３ ０
２１ ０ １年
第３ ４卷
（ ｅ ｒｌ ｔｍ ｃｌ ， Ｓ ｓ ｎ ｕａ ｓ ｅ ｓ Ｎ Ｃ ）是一 类具 有 自我 复制 及多 ｅ ｌ
可靠 、 简便 的培 养方 法 。
１ 材 料 与方法
１１ 动物 与试 剂 ．
新生 １ ｄ大 鼠 ２只 ， 由泸州 医学 院实 验 动物 中心
提供 ； 皮 细胞 生 长 因子 （Ｇ ） 自 Ｇ Ｂ Ｃ； ＭＥ 表 ＥＦ购 Ｉ Ｉ Ｄ Ｍ／ Ｆ ２培养基 、 ２培养 基添 加剂 购 自 Ｓｇ ａ公 司 ； 蛋 １ Ｎ ｉｍ 巢 白（ ｅｔ ） 克 隆抗 体 、 管 相 关 蛋 白 （ Ｐ ） 克 ｎ ｓｎ 多 ｉ 微 ＭＡ ２ 单
小鼠海马区神经元的培养
小鼠海马区神经元的培养:实验材料：1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。
2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。
分装储存。
临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。
在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。
次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。
3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml 10x 平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS）HEPES 3.9g,NaHCO3 0.84g，青霉素104 U,链霉素100mg，H2O 800ml。
以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm直径的滤菌器过滤，4℃保存。
4、DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min 灭活）1% 的青/链霉素.5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。
7、台盼蓝(typan blue )溶液终浓度为0.2%-0.4%。
8、阿糖胞苷终浓度为8-10 μmol/L。
9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。
实验步骤：1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。
2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS？）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。
原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定
第４ ４卷
３２ ２
第 ４期
哈尔滨医科 大学学报
Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢ Ｎ ＭＥＤ ＣＡＬ ＵＮＩ Ｉ Ｉ ＶＥＲＳ ＩＹ Ｉ
Ｖｏ ． ４， ． １ ４ Ｎｏ ４ Ａｕ ．，２ １ ｇ ００
２１ ０ ０年 ８月
原代 海 马 神 经 细胞 体 外 培养 的纯 化 与鉴定
在体外采用含血清结合无血清法进行培养 ， 并用 Ｎ Ｅ Ｇ Ｐ４ 、 Ｐ Ｓ 、 Ａ －３ ＭＡ ２等海马神经 细胞 特异抗体经 免疫细胞化学 方
法鉴定细胞性质及纯度。结果 度达 ９ ％以上。结论 ６ 至第 ７ ・ ８天神经元形态最为成熟饱满 ， 随后逐渐 出现 细胞 老化 ， 神经元 最长可 生存 ４周 。经鉴 定 ， 马神经元 纯 海 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代 海马神经细胞 培养 ， 细胞纯度高 ， 杂细胞少 ， 可 为神经疾病体外研究提供 必要 细胞基础 。
ｍａ ｕｔｒ ｆ ｉｐ ｃ ｍｐ ｌ ｅ ｒｎ ｉ ｅｕ ｍｅ ｉｍ ｎ ｅｕ ｆｅ ｄｕ ｉ ｉ ｏｉ ｗ ｔ ｉｈ ｐ — ｙ ｒ ｃ ｌ ｅｏ ｐ ｏ ａ ａ ｕｏ ｓｗ ｔ ｓ ｒｍ ｄｕ ａ ｄ ｓｒ ｍ— ｅｍｅ ｉｍ ｎｖｔ ｓ ｉ ｈｇ ｕ ｕ ｈ ｎ ｈ ｒ ｒ ｈ
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原代神经元培养的概念
原代神经元培养的概念一、神经元的获取原代神经元培养的第一步是从动物脑组织中获取神经元。
通常，新生动物（如新生小鼠）的脑组织被用于这一目的，因为新生动物的神经元具有较强的增殖能力。
获取的神经元可以通过酶消化或物理分散法进行处理，使组织分离成单个细胞。
二、培养基的选择培养基是原代神经元生长的必要条件，它提供了神经元所需的营养物质、激素和生长因子。
为了维持神经元的生长和存活，需要选择适当的培养基，以满足神经元的特殊营养需求。
常用的培养基有DMEM、MEM、F-12等。
三、培养条件控制原代神经元培养需要在一定的条件下进行，包括温度、湿度、气体（如O2和CO2）浓度等。
这些条件对神经元的生长和分化有重要影响，因此需要精确控制。
温度的稳定性对于维持细胞活性至关重要，而气体浓度则影响细胞的代谢和pH值。
四、神经元的生长与分化在适宜的培养条件下，获取的神经元开始生长并增殖。
在生长过程中，神经元会通过突起与其他神经元建立连接，形成复杂的网络结构。
随着时间的推移，这些神经元还会分化成不同的类型，执行特定的功能。
五、神经元网络的建立在原代神经元培养过程中，神经元会形成复杂的网络结构。
这些网络通过突触连接，传递电化学信号，模拟生物体内的神经网络。
通过观察神经元网络的建立，可以深入了解神经元的生长和功能机制。
六、培养过程中的监测与观察在原代神经元培养过程中，需要定期对细胞进行监测和观察，以了解细胞的生长状态、形态变化以及是否存在异常。
可以使用显微镜、电生理技术等方法对神经元进行监测。
通过这些手段，可以及时发现并解决培养过程中出现的问题。
七、培养物的应用与价值原代神经元培养在科学研究、药物筛选和疾病模型构建等方面具有广泛的应用价值。
通过原代神经元培养，可以深入了解神经系统的生理和病理机制，为药物研发提供有效的工具。
此外，原代神经元培养还为神经系统疾病的动物模型提供了替代方案，有助于研究疾病的发病机制和治疗方法。
总的来说，原代神经元培养是一种重要的实验手段，有助于推动神经系统科学的发展和进步。
原代细胞的培养
原代细胞的培养原代细胞的培养不知道遭到多少研究生及博士生吐槽，其真实情况是，一边在超净工作台上哭，一边手上还在不停地提取原代细胞。
相比较细胞系细胞而言，原代细胞的培养周期长、成本高、摸索困难。
从大鼠的筛选分笼到母鼠受精怀孕，从孕育周期的看护到胎鼠的出生降临，从胎鼠脑组织的提取到神经细胞的培养，到最后的药物对原代细胞的作用机制研究。
这种复杂和辛苦的原代培养过程，其实也是最能反应药物在实验小白鼠上作用机制和效果最真实的反应。
1、大鼠的筛选和分笼首先是一个大笼子里放6只大鼠（5雌性，1雄性），每隔两天喂水和繁殖饲料，一星期给大鼠换一次垫料（给大鼠换垫料是体力活）。
舒适的空间和环境能让大鼠更好地繁殖，产下更多的胎鼠用于科学研究。
2、原代细胞的提取及培养原代细胞的提取一般是将胎鼠先用纯净水冲洗干净，在放进超净工作台处理。
先将胎鼠放入75%酒精消毒1min,再用手术剪刀将胎鼠的脑组织提取出来，放入遇冷的D-Hank's液中。
用手术剪刀将皮层的脑组织剪碎，加入等体积的0.25%胰酶进行消化，置于二氧化碳培养箱37℃培养。
（1）新生大鼠原代海马组织中神经干细胞的培养取新生24h内新生大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，用剪刀将头颅取下，剥离颅骨，暴露皮质下海马组织，于冰上快速取出组织放在遇冷的DMEM/F12或者PBS缓冲液中清洗，吸出置于15mLEP中，加入ACCUTASE1.5-2.0mL置于培养箱中，37℃、5%CO2混匀消化10min，取出混匀吹打组织块，1000r.5min-1离心，加入培养基重悬细胞过200目细胞筛（70μm），置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。
通过Nestin染色鉴定星形胶质细胞以确保纯度。
（2）大脑皮层原代星形胶质细胞培养细胞制备和培养从1 日龄新生Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层制备原代星形胶质细胞。
简而言之，分离大脑皮质并用0.25% 胰蛋白酶在37°C下消化15 分钟，然后通过70 μm 细胞过滤器过滤。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
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新生鼠海马、皮层神经元原代培养
实验材料
1. 实验动物
新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂
Hibernate A
Neurobasal A
B27 serum-free supplements
Papin （木瓜蛋白酶）
DNAase I
OptiPrep Density Gradient Medium
Poly-L-lysine （多聚赖氨酸）
L-glutamine （L-谷氨酰胺）
Penicillin （青霉素）
Streptomycin （链霉素）
D-Hank’s solution
dd H2O
3. 溶液配制
1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。
（可配成25×）
2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。
在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。
可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。
现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。
现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法
1. 包被培养皿
使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
2. 组织剥离
取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。
无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。
首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。
分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。
用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。
3. 消化和分散
用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。
消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，
用1mL移液枪吹打细胞（慢吸快吹）10次，静置2 min，小心吸取上部细胞悬液，再加入2 mL HABG，200 μL DNAase I，吹打10次，静置2 min，小心吸取上部细胞悬液，必要可再重复一次。
将细胞悬液过400目细胞筛网，然后小心加至离心介质上，每管约6 mL。
1900 rpm离心15 min。
离心后细胞留在介质和终止液交接部，血细胞被离至管底。
吸掉上部终止液后，小心吸取细胞至另一离心管，加入8~10 mL Neurobasal A/B27将细胞重悬，1100 rpm离心5 min，弃上清，加入2 mL Neurobasal A/B27将细胞重悬，此时若有无法吹散的絮状物弃掉，或将离心管静置片刻，待其沉淀后吸取上边细胞悬液至另一离心管，加入8~10 mL Neurobasal A/B27将细胞重悬，1100 rpm离心5 min，弃上清，加入2~3 mL Neurobasal A/B27重悬。
4. 计数和接种
取少量细胞悬液以苔盼蓝染液观察存活率并计数。
1×106/孔的密度接种在多聚赖氨酸包被的6孔板中，置于37 °C，5% CO2培养箱。
5. 洗板和换液
细胞种下6小时后应贴壁良好，十字摇板10~15次，吸出种植液，用37°C 预热的D-Hank’s液洗板3次，每次摇板10~15次。
镜检碎片基本洗净后，每孔加入2mL 含双抗、谷氨酰胺的Neurobasal A/B27置于37 °C，5% CO2培养箱。
以后每3天换半液。
5. 神经元的形态学观察
分散培养的大鼠海马神经元，在接种1 h后即可贴壁，细胞呈单个圆形或椭圆形。
2~3 d后细胞明显增大，突起长出并延伸。
6~7 d时神经元在相差显微镜下可见具有明显的光晕。
此时神经元呈三角形或多边形，边界清晰，胞体明亮，胞
核和核仁清晰可见。
在培养过程中神经元之间的纤维联系逐渐丰富，并形成网络。
随着培养时间的延长，海马神经元逐渐退化变性，表现为神经元胞体光晕消失，胞体皱缩，突起萎缩，有的出现空泡，直至脱落，造成神经元的数量逐渐减少。
注意事项：
1．分离组织要迅速，尽量减少操作时间。
因用Optiprep介质离心时可分离血细胞，分离组织时可不必过细的剔除血点。
2．用于分离组织的液体不能偏碱，会明显影响细胞状态。
3．消化后的组织会释放DNA，导致组织粘稠无法吹开，DNAase可以有效缓解此现象，若发现在上述DNAase量下仍有粘稠，可适当增加
DNAase量。
粘稠的物质在过筛时无法筛掉，种板后会很快黏至板底，
洗板时无法洗掉，其周围很大面积内没有细胞，严重影响实验成败。
4．种板时细胞密度至少在1×106/孔（6孔板），过稀细胞无法生长。
5．细胞贴壁6小时后及时洗板，时间长后碎片不易洗掉，影响细胞生长。