限制性核酸内切酶消化DNA ppt课件
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不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
15
六、注意事项
5、酶切消化反应的温度： DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一
个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最 适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃， 少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。
16
六、注意事项
6、酶切消化反应的时间： 反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则
7
二、实验原理
EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-T
Easy质粒DNA切开成为线性DNA。用未
经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电
3000bp
泳迁移率的比较，就可以推测酶切是
否成功。 图片说明：
2000bp 1000bp
600bp
1 未经酶切的质粒DNA
500bp
2 经EcoRⅠ或HindⅢ酶切后的线性DNA 和目的DNA
3
二、实验原理
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割， 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有 的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（ 3 ’ 突出和5 ’突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如 EcoRⅠ、HindⅢ 切割识别序列后产生两个互补的粘性末 端。
4
EcoRⅠ 5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
HindⅢ 5ˊ-A↓AGCTT-3ˊ 3ˊ-TTCGA↑A-5ˊ
5ˊ-A
AGCTT-3ˊ
3ˊ-TTCGA +
A-5ˊ
5
二、实验原理
质粒是细菌细 胞内独立于染色 体之外能自主复 制的双链环状DNA 分子。本实验用 到的是pGEM-T Easy质粒。
酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存 在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制作用可通过下列方式克服： （1）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA）、 （2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂 （3）延长反应时间
14
六、注意事项
4、反应缓冲液的影响 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl）
实验二 限制性核酸内切酶消化质粒DNA
1
一、实验目的 1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。 2.了解酶切反应条件。
2
二、实验原理
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定 核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核 酸内切酶。
在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能 在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双 链DNA分子断开。
6Байду номын сангаас
二、实验原理
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以 分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 质粒有3种构型： 1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA ； 2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂； 3、线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂。 这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳 后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质 粒DNA。
12
六、注意事项
2.内切酶的使用时注意： (1)不使其污染与浪费； (2)注意加样顺序； (3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活 性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、 高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。
13
六、注意事项
3.质粒DNA对结果的影响： 作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含
18
谢 谢 各 位
19
8
_
Marker 1
2
+
目的DNA
三、仪器与试剂
主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪
主要试剂：限制性核酸内切酶（ EcoRⅠ、HindⅢ ）
10×酶切缓冲液 琼脂糖 上样缓冲液 0.5×TBE缓冲液 质粒DNA
9
四、实验步骤
1.建立反应体系：0.5mL无菌的EP管 (总体积20μL)
无菌双蒸水
是DNA:酶=２-３:１。 本实验1小时即可充分酶解。
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六、注意事项
7、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法： （1）采用65℃条件下温浴20min，通过加热失活内切酶； （2）加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的 终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切 酶变性以终止反应.
12μL
质粒
2μL
10×buffer酶切缓冲液 2μL 轻轻混匀，低速
内切酶
短暂离心
EcoRⅠ
4μL
2.37℃，水浴1h。 3.低速短暂离心。 4.加4μL上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳 （100V,40min）。(取12μL点样)
10
五、实验结果
质粒酶切电泳图
11
六、注意事项
1、操作时注意： （1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。 （2）要求在冰上操作，并充分混匀。 （3）打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。 （4）水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。
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六、注意事项
5、酶切消化反应的温度： DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一
个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最 适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃， 少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。
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六、注意事项
6、酶切消化反应的时间： 反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则
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二、实验原理
EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-T
Easy质粒DNA切开成为线性DNA。用未
经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电
3000bp
泳迁移率的比较，就可以推测酶切是
否成功。 图片说明：
2000bp 1000bp
600bp
1 未经酶切的质粒DNA
500bp
2 经EcoRⅠ或HindⅢ酶切后的线性DNA 和目的DNA
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二、实验原理
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割， 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有 的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（ 3 ’ 突出和5 ’突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如 EcoRⅠ、HindⅢ 切割识别序列后产生两个互补的粘性末 端。
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EcoRⅠ 5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
HindⅢ 5ˊ-A↓AGCTT-3ˊ 3ˊ-TTCGA↑A-5ˊ
5ˊ-A
AGCTT-3ˊ
3ˊ-TTCGA +
A-5ˊ
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二、实验原理
质粒是细菌细 胞内独立于染色 体之外能自主复 制的双链环状DNA 分子。本实验用 到的是pGEM-T Easy质粒。
酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存 在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制作用可通过下列方式克服： （1）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA）、 （2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂 （3）延长反应时间
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六、注意事项
4、反应缓冲液的影响 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl）
实验二 限制性核酸内切酶消化质粒DNA
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一、实验目的 1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。 2.了解酶切反应条件。
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二、实验原理
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定 核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核 酸内切酶。
在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能 在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双 链DNA分子断开。
6Байду номын сангаас
二、实验原理
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以 分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 质粒有3种构型： 1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA ； 2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂； 3、线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂。 这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳 后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质 粒DNA。
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六、注意事项
2.内切酶的使用时注意： (1)不使其污染与浪费； (2)注意加样顺序； (3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活 性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、 高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。
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六、注意事项
3.质粒DNA对结果的影响： 作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含
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谢 谢 各 位
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Marker 1
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目的DNA
三、仪器与试剂
主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪
主要试剂：限制性核酸内切酶（ EcoRⅠ、HindⅢ ）
10×酶切缓冲液 琼脂糖 上样缓冲液 0.5×TBE缓冲液 质粒DNA
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四、实验步骤
1.建立反应体系：0.5mL无菌的EP管 (总体积20μL)
无菌双蒸水
是DNA:酶=２-３:１。 本实验1小时即可充分酶解。
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六、注意事项
7、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法： （1）采用65℃条件下温浴20min，通过加热失活内切酶； （2）加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的 终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切 酶变性以终止反应.
12μL
质粒
2μL
10×buffer酶切缓冲液 2μL 轻轻混匀，低速
内切酶
短暂离心
EcoRⅠ
4μL
2.37℃，水浴1h。 3.低速短暂离心。 4.加4μL上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳 （100V,40min）。(取12μL点样)
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五、实验结果
质粒酶切电泳图
11
六、注意事项
1、操作时注意： （1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。 （2）要求在冰上操作，并充分混匀。 （3）打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。 （4）水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。