蛋白质相互作用多种方法

优点： 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； 2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； 3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白 复合物。
缺点： 1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用； 2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用； 3、如用western blot检验，必须在实验前预测目的 蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不 正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性， 灵敏度不如亲和色谱高。
蛋白质相互作用研究方法
生物物理学方法 分子生物学方法 遗传学方法
Pull down 试 验
免 疫 共 沉 淀
串 联 亲 和 纯 化
噬 菌 体 展 示 技 术
酵 母 双 杂 交 技 术
基 因 外 抑 制 子
合 成 致 死 筛 选
免疫共沉淀
（co-immunoprecipitation，CO-IP）
人类蛋白质组相用
蛋白质相互作用： 1. 本身具有生物学意义：这样的相互作 用在生物体中是起什么作用 2. 发展技术：利用这样的相互作用创造 出一些人为的作用
运用生物信息 学的方法由繁 入简
实验分析 的方法由 简入繁
整体
系统
部分 单体
酵母蛋白质相互作用联络图 人蛋白质相互作用联络图
研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相 互作用的生物学意义
串联亲和纯化（ TAP）
近年来质谱技术发展迅速，其功能强大且灵敏 度高，常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合 体亚基 ，但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复 合体，成为质谱在这方面应用的一个限速步骤。 1999年Rigaut （德国）等人共同提出了一套分离 复合蛋白的新方法—串联亲和纯化(Tandem affinity purification，TAP)，兼具标准亲和纯化 （可以得到高纯度地拷贝数的蛋白质复合体）和免 疫共沉淀（用于特异性的标记蛋白与亲和柱之间的 相互作用）两种生化方法的优点，为蛋白质复合体 的分离鉴定提供了一条新路径。
GST-Pull down Assay
右：对照， 中间翻转混 合时发生相 互作用，胶 上只与GST 融合蛋白结 合而不与 GST结合的 特异性条带 表示新的相 互作用蛋白。
GST pull down
GST Fusion Protein Purification
binding
wash
elution
Mammalian Tap-tag-LC-MS/MS method
TAP优点



加工和修饰过的蛋白可以作诱饵，相互作用发生在天然环 境和细胞部位，一次操作可以分离和分析多组分的复合物， 得到广泛应用， 由于TAP标签的高度特异性以及采用两步洗脱纯化法，在 纯化过程中不需要强烈冲洗，因此可以更好地保持较不稳 定的蛋白质复合物，而且非特异蛋白的量也会很低，这是 一步纯化法所不能比拟的。 克服了双杂交筛选步骤复杂、假阳性结果较多、难于量化、 不能满足大规模蛋白质组研究需要的缺陷。
应用： • 一确定融合（或探针）蛋白与未知（或 靶）蛋白间的新的相互作用； • 一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在 相互作用。
特点： 比较简便，如果用抗GST抗体检测或生物素标记融合蛋 白避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究 中有很广泛的应用。 融合蛋白具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白 的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动 物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。 注意： 该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保 持蛋白质活性的重组融合蛋白，且无过度降解（探针蛋白 变成不同降解产物的混合物）和不溶，以及如何避免内源 性诱饵蛋白的干扰。
GST pull-down技术
1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一 步纯化出GST融合蛋白,从此GST融合蛋白在研究 蛋白质相互作用领域得到极大推广(His也常用)。 此方法是一个行之有效的验证酵母双杂交系统 的体外试验技术。还应当在体内用单独的方法， 如免疫共沉淀加以证实。
原 理
一、酵母双杂交系统基本原理
1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用 了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域,DNA结合域 (DNA binding domain,BD)及转录激活域(activation domain,AD),将已知基因(诱饵基因)和靶基因或含有靶基 因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上,将这两种质粒 共同转化酵母感受态细胞,若BD结合的诱饵蛋白能够与AD 结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼 此间结合时,则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近,呈 现GAL4转录因子的完全活性,启动下游的报告基因如His及 LacZ等基因的表达,从而在特定的缺陷培养基上生长。
蛋白质相互作用研究方法
赵丽娜
Protein interaction：two or more proteins (same or different) interact or form complex
蛋白质相关知识及研究蛋白 质相互作用的必要性
有一些蛋白质可以以单体的形 式发挥作用，但是大部分的蛋 白质都是和伴侣分子或是与其 他蛋白质一起发挥作用的。
主要用于： 两种感兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用； 也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白。
注意： 1 要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不 变。因为出现假阳性的概率比较高。 2 设置的对照：在对照组中使用对照抗体，以 缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。
Western blot
1、电转移效率 2、PVDF膜的充分浸润 3、转移液中有太多的SDS 4、膜的损坏 5、转移时胶和膜没有完全接触 6、抗体的问题 7、抗体的浓度太高或太低 8、还原性物质的存在 9、封闭不充分
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保 留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X， 那么与X在体内结合的蛋白质Y也可能沉淀下来。 蛋白质Y的沉淀是基于与蛋白质X的物理性相互 作用，称为免疫共沉淀。
• Western blot：变性抗原，主要用于 检测蛋白质的存在与否。 • 免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴 定不同蛋白质间的相互作用。多采 用非离子变性剂（NP40或Triton X100)
实验流程
1、基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因 置换为带有TAP标签的基因，温和裂解细 胞，获取细胞抽提物。 2、将抽提物加入IgG亲和柱，TAP标签的 ProtA端会与IgG形成强结合，在用洗脱液 洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白。
3、含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割 下来。在钙离子参与下，被切割下来带有CBP的 蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，充分洗脱， 就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质，最 后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。 4、经过串联亲和纯化的目的蛋白，通过SDSPAGE或者双向电泳分离之后，找出与目的蛋白 相互作用的蛋白质，采用质谱分析的方法对其进 行分析鉴定。
• 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、 等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域 (DNA-binding domain)和转录激活结构域 (transcription-activating domain)。 • 前者可识别DNA上的特异17bp长序列 （UAS），并使转录激活结构域定位于所调节 的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合 体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转 录。
适用： 研究蛋白质复合体中多个蛋白质间的相互 作用，特别适用于研究蛋白质在生理条件 下的相互作用
原理方法
首先通过基因工程给 被分离纯化蛋白的一 端加一个TAP标签， 该标签由IgG结合结 构域 (ProtA)及一个 钙调蛋白结合多肽 (CBP)组成，结构域 与多肽之间由一个 TEV蛋白酶切位点隔 开。
生物学效应
稳定相互作用 形成蛋白质复合体
瞬时相互作用
（enzyme-substrate） （protein complex）
稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋 白质相互作用的内涵。
研究蛋白质相互作用是为了研究相应的 生物学功能
确定研究目标
寻找相互作用
建立相互作用网络 和功能体系
Βιβλιοθήκη Baidu
• 从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直 接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些 作用的生物学意义。 容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知 道这些相互作用有什么生物学意义。 • 从生物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物 学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步 研究相关蛋白质的相互作用。 容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。
亲和纯化（ affinity purification ）
• 纯化： 抗体 Epitope-tag：flag, myc, HA, V5, GST… 核酸 • Pull-down • Immunoprecipitation • TAP (Tandem Affinity Purification)
酵母双杂交（Yeast two-hybrid ）
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题 A
B
Y
B Y Y A
非特异性
实验过程
实验过程
• （1）加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清； • （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应 的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； • （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次 3,000 rpm离心3 min； • （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜 的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂 糖珠偶连； • （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将 琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲 液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； • （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
靶蛋白X基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载 体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X） 把GST融合蛋白(探针、诱饵蛋白)挂到带有GST 底物的Sepharose beads上，然后把另一种含目 的蛋白质（捕获蛋白）的溶液加入其中。由于谷 胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如发 生相互作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀收集 下来，洗脱非特异结合的蛋白后采用SDS-PAGE 鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。
TAP缺点

更倾向于高丰度和稳定的相互作用，许多低亲和力、瞬 时和依赖特殊细胞环境的相互作用可能检测不到。 另外，TAP必须采用能产生表达TAP标签的蛋白，这种 标签蛋白的表达最好接近生理水平，所以最好将带标签 的基因用天然启动子表达。但在哺乳动物细胞中，天然 启动子表达标签蛋白是非常困难的，其表达水平不同于 无标签的内源蛋白，由非生理水平的诱饵蛋白而产生假 阳性。
GST pull down
GST fusion protein 不够纯， 用作bait会产生太多的非特 异性蛋白质污染。
检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用：
1、放射性标记融合蛋白：快速简单易行 2、抗GST抗体检测 3、生物素标记融合蛋白：没有放射性，但可能对探 针蛋白和其他蛋白的相互作用有影响。
蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规 律，是研究蛋白质相互作用的核心 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了 遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适的研究方法
研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合
象与象的一部分
研究蛋白质相互作用的意义 1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动 的基础。
2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是 发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是 发挥其功能的主要活动。
实 验关键
1、 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不 同和抗原结合能力也不同，特别是多抗的特异 性是问题。 2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液 必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检 出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存 在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则 抗原被稀释。