饲料中霉菌毒素检测技术
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T-2毒素 伏马毒素
紫外检测器 荧光检测器
荧光检测器 荧光检测器 串联质谱 需柱前化学衍生 荧光检测需柱前 化学衍生
甲醇-水
甲醇-水 甲醇-水
免疫亲和柱
免疫亲和柱 免疫亲和柱 SAX净化柱
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
2、免疫亲和柱净化原理
加入待净化样本 洗涤干扰物 洗脱目标物
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
检测方法
高效液相色谱法（荧光） 酶联免疫吸附法 薄层色谱法 液相色谱-串联质谱法 胶体金法 荧光光度法 免疫层析法 高效液相色谱法 高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱法 酶联免疫吸附法 高效液相色谱法 液相色谱-串联质谱法 高效液相色谱法（紫外） 薄层色谱法
高效液相色谱法
黄曲霉毒素
NY/T 2071-2011 NY/T 2550-2014 NY/T 2549-2014 NY/T 2548-2014 DB37/T 2617-2014 GB/T 28716-2012
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
1、HPLC法检测霉菌毒素的关键点比较
霉菌毒素 名称
黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮
提取液
甲醇-水 乙腈-水 水
净化
免疫亲和柱 多功能净化柱 免疫亲和柱 免疫亲和柱
检测器
荧光检测器 串联质谱 荧光检测器 串联质谱
备注
荧光检测需柱前 光化学衍生
脱氧雪腐镰刀菌 烯醇（呕吐毒素） 赭曲霉毒素A
•
•
加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染
拍板用力适当，看不到明显液体为宜
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（5）显色 • • • • 加显色液要快速准确 回形振荡混匀，消除气泡 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内液体挥发，加以密封
（6）显色终止
•
•
按照加显色液的顺序及速度加终止夜
4、其他注意事项
取样和制样 玻璃纤维滤纸不得含荧光物质 基质效应
质量第一
公正科学 及时准确
氧雪腐镰刀菌稀醇（呕吐毒素）等6种毒素
一、饲料中霉菌毒素的危害
4、霉菌毒素的主要危害
一是可以引起饲料的变质，产生异味，降低 其饲用价值，甚至完全让其失去商品价值
二是饲料被霉菌污染后，导致畜禽的急、慢 性中毒，免疫机能和生产性能下降，造成养 殖业效益的下降
三是残留于畜禽肌肉、内脏或乳中的霉菌毒 素通过食物链传递给消费者，给食品安全带 来更大的风险
3、免疫亲和柱使用注意事项
免疫亲和柱应在2~8℃保存，不要冷冻，关注有效期 免疫亲和净化柱使用前要恢复其温度至室温（20-25℃ ） 整个纯化过程尽量不要让柱子干涸 免疫亲和净化柱不能混用
具体使用方法按照说明书操作，不可完全按检测标准生
搬硬套
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
玉米赤霉烯酮
GB/T19540-2004 DB51/T 1080-2010
DB22/T 1618-2012
脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （呕吐毒素）
GB/T 30956-2014 GB/T 8381.6-2005 DB51/T 1079-2010 GB/T 30957-2014
高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱方法 酶联免疫吸附测定法 高效液相色谱法 高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱法 高效液相色谱法 液相色谱串联质谱法 高效液相色谱法（荧光） 高效液相色谱法
赭曲霉毒素A
GB/T19539-2004 DB51/T 1081-2010 GB/T 28718-2012
T-2毒素 伏马毒素
GB/T 8381.4-2005 DB51/T 1078-2010 NY/T1970-2010 DB51/T 1082-2010
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
2、霉菌毒素的主要检测方法
2、检测步骤及注意事项
（1）准备阶段 • • • 详细阅读说明书 确认试剂盒试剂组成、数量及其用途 试剂配制
•
• • • •
试样的制备、提取及稀释
试剂盒试用前要充分回温 实验室室温最好控制在20-25℃ 准备好实验器具（移液枪机及枪头） 确认仪器设备运行正常
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、检测步骤及注意事项（续）
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
1、饲料中主要霉菌毒素的检测标准一览表
霉菌毒素名称 标准号
GB/T 30955-2014 GB/T 17480-2008 GB/T 8381-2008
标准名称
饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 胶体金法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法 饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 饲料中赭曲霉毒素A的测定 饲料中赭曲霉毒素A的测定 高效液相色谱法 饲料中T-2毒素的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 配合饲料中T-2毒素的测定薄层色谱法 饲料中T-2毒素的测定高效液相色谱法 饲料中伏马毒素的测定（伏马毒素B1和伏马毒素B2含量） 饲料中伏马毒素B1的测定 高效液相色谱法
胶体金免疫层析法
酶联免疫吸附法
荧光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱（荧光/紫外）法 高效液相色谱串联质谱法
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
3、主要检测方法的特点比较
色谱方法
样品处理 检测时间 检测通量 复杂，需要净化柱纯化操作 30-60分钟 单个样品，一种或多种毒素
ELISA
检测效率
几乎可以处理任何样品
可以进行多毒素检测
对样品基质要求高
只能完成单一毒素检测
对样品基质要求非常高
只能完成单一毒素检测
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
4、检测方案
初筛
胶体金 ELISA
批量样本 可疑样品
阳性样确证 √液 质 联 用 高 效 液 相 荧 光 分 析
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
真菌
霉菌
霉菌毒 素
蕈菌
一、饲料中霉菌毒素的危害
2、霉菌毒素产生的原因
霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、 运输和储存期间生长并产生毒素 农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运 输过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭 受霉菌毒素污染
一、饲料中霉菌毒素的危害
3、霉菌毒素的种类
现已报道的霉菌毒素大约有300种 在饲料中常见的、对人和动物健康造成潜在 危害的毒素主要有：黄曲霉毒素、玉米赤霉 烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素和脱
饲料中霉菌毒素检测技术
交流提纲
一、饲料中霉菌毒素的危害
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
三、ELISA法的操作要点及注意事项
四、 HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
质量第一 公正科学 及时准确
一、饲料中霉菌毒素的危害
1、什么是霉菌毒素？
霉菌毒素是霉菌产生的次级代谢产物
酵母
次 级 代 ห้องสมุดไป่ตู้ 产 物
抗生素
回形振荡混匀液体
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（6）读数（检测吸光度） • • 终止反应后应尽快检测吸光度 按照说明书要求设置酶标仪参数
三、ELISA法的操作要点及注意事项
3、其他应注意的问题
劳动安全保护及环境保护 不同批次的试剂盒微孔板不要混用
试剂盒质量差异（重复性、准确性）明显
知抗体
将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液
双抗体夹心法
相中的可溶性抗原
竞争法
将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗 体检测液相中的可溶性抗原或抗体
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、竞争 ELISA 的原理
三、ELISA法的操作要点及注意事项
枪头一次性使用
试样加入后的 步骤枪头不接触微孔 使用硅化枪头 高质量移液枪+配套墙头+人员操作训练 轻轻回形振荡
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（3）孵育 • • • • 孵育前应混匀反应物 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内液体挥发，加以密封
（4）洗板 甩除液体要干净利落，不要投鼠忌器
（2）加样
标准曲线孔--- 酶标抗原 + 标准曲线溶液 样品测试孔--- 酶标抗原 + 样品提取物溶液 注意事项：
加样体积准确
前后加样时间不宜过长 不可漏孔、跳孔 防止交叉污染
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项（续）
容易出现的问题 解决方法
一次检测不要检测太多样品 加样时间过长，导 致前后反应时间差 加样使用使用单枪，其他步骤使用排枪 异大 先将酶标抗原和样品提取液在空白微孔板中混合均 匀，再用多通道移液器将混合液加到检测微孔板中 交叉污染 液体挂壁排不尽 移取体积不一致 产生气泡
5、检测流程
取样
制样
GB/T14699.1 2005 饲料 采样
GB/T20195 动物饲料试样的制备
萃取 净化（主要用于色谱法） 分析测试
三、ELISA法的操作要点及注意事项
1、酶联免疫吸附（ ELISA ）试验的定义及分类
定义：用酶标记抗原或抗体检测液体中未知抗体或抗原的方法。 分类：
间接法
简单，只需萃取过滤 30-60分钟 多个样品，一个毒素
试纸条
简单，只需萃取过滤 5-10分钟 单种样品
仪器成本 准确度
检测成本 人员技术要求
昂贵（HPLC,LC-MS/MS） 高
昂贵 专业技术背景 复杂的培训
便宜 （酶标仪） 中
便宜 无需专业背景，简单培训
无需仪器 低
便宜 无需专业背景，简单培训
样品要求
紫外检测器 荧光检测器
荧光检测器 荧光检测器 串联质谱 需柱前化学衍生 荧光检测需柱前 化学衍生
甲醇-水
甲醇-水 甲醇-水
免疫亲和柱
免疫亲和柱 免疫亲和柱 SAX净化柱
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
2、免疫亲和柱净化原理
加入待净化样本 洗涤干扰物 洗脱目标物
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
检测方法
高效液相色谱法（荧光） 酶联免疫吸附法 薄层色谱法 液相色谱-串联质谱法 胶体金法 荧光光度法 免疫层析法 高效液相色谱法 高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱法 酶联免疫吸附法 高效液相色谱法 液相色谱-串联质谱法 高效液相色谱法（紫外） 薄层色谱法
高效液相色谱法
黄曲霉毒素
NY/T 2071-2011 NY/T 2550-2014 NY/T 2549-2014 NY/T 2548-2014 DB37/T 2617-2014 GB/T 28716-2012
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
1、HPLC法检测霉菌毒素的关键点比较
霉菌毒素 名称
黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮
提取液
甲醇-水 乙腈-水 水
净化
免疫亲和柱 多功能净化柱 免疫亲和柱 免疫亲和柱
检测器
荧光检测器 串联质谱 荧光检测器 串联质谱
备注
荧光检测需柱前 光化学衍生
脱氧雪腐镰刀菌 烯醇（呕吐毒素） 赭曲霉毒素A
•
•
加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染
拍板用力适当，看不到明显液体为宜
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（5）显色 • • • • 加显色液要快速准确 回形振荡混匀，消除气泡 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内液体挥发，加以密封
（6）显色终止
•
•
按照加显色液的顺序及速度加终止夜
4、其他注意事项
取样和制样 玻璃纤维滤纸不得含荧光物质 基质效应
质量第一
公正科学 及时准确
氧雪腐镰刀菌稀醇（呕吐毒素）等6种毒素
一、饲料中霉菌毒素的危害
4、霉菌毒素的主要危害
一是可以引起饲料的变质，产生异味，降低 其饲用价值，甚至完全让其失去商品价值
二是饲料被霉菌污染后，导致畜禽的急、慢 性中毒，免疫机能和生产性能下降，造成养 殖业效益的下降
三是残留于畜禽肌肉、内脏或乳中的霉菌毒 素通过食物链传递给消费者，给食品安全带 来更大的风险
3、免疫亲和柱使用注意事项
免疫亲和柱应在2~8℃保存，不要冷冻，关注有效期 免疫亲和净化柱使用前要恢复其温度至室温（20-25℃ ） 整个纯化过程尽量不要让柱子干涸 免疫亲和净化柱不能混用
具体使用方法按照说明书操作，不可完全按检测标准生
搬硬套
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
玉米赤霉烯酮
GB/T19540-2004 DB51/T 1080-2010
DB22/T 1618-2012
脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （呕吐毒素）
GB/T 30956-2014 GB/T 8381.6-2005 DB51/T 1079-2010 GB/T 30957-2014
高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱方法 酶联免疫吸附测定法 高效液相色谱法 高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱法 高效液相色谱法 液相色谱串联质谱法 高效液相色谱法（荧光） 高效液相色谱法
赭曲霉毒素A
GB/T19539-2004 DB51/T 1081-2010 GB/T 28718-2012
T-2毒素 伏马毒素
GB/T 8381.4-2005 DB51/T 1078-2010 NY/T1970-2010 DB51/T 1082-2010
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
2、霉菌毒素的主要检测方法
2、检测步骤及注意事项
（1）准备阶段 • • • 详细阅读说明书 确认试剂盒试剂组成、数量及其用途 试剂配制
•
• • • •
试样的制备、提取及稀释
试剂盒试用前要充分回温 实验室室温最好控制在20-25℃ 准备好实验器具（移液枪机及枪头） 确认仪器设备运行正常
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、检测步骤及注意事项（续）
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
1、饲料中主要霉菌毒素的检测标准一览表
霉菌毒素名称 标准号
GB/T 30955-2014 GB/T 17480-2008 GB/T 8381-2008
标准名称
饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 胶体金法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定薄层色谱法 饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 饲料中赭曲霉毒素A的测定 饲料中赭曲霉毒素A的测定 高效液相色谱法 饲料中T-2毒素的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 配合饲料中T-2毒素的测定薄层色谱法 饲料中T-2毒素的测定高效液相色谱法 饲料中伏马毒素的测定（伏马毒素B1和伏马毒素B2含量） 饲料中伏马毒素B1的测定 高效液相色谱法
胶体金免疫层析法
酶联免疫吸附法
荧光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱（荧光/紫外）法 高效液相色谱串联质谱法
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
3、主要检测方法的特点比较
色谱方法
样品处理 检测时间 检测通量 复杂，需要净化柱纯化操作 30-60分钟 单个样品，一种或多种毒素
ELISA
检测效率
几乎可以处理任何样品
可以进行多毒素检测
对样品基质要求高
只能完成单一毒素检测
对样品基质要求非常高
只能完成单一毒素检测
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
4、检测方案
初筛
胶体金 ELISA
批量样本 可疑样品
阳性样确证 √液 质 联 用 高 效 液 相 荧 光 分 析
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
真菌
霉菌
霉菌毒 素
蕈菌
一、饲料中霉菌毒素的危害
2、霉菌毒素产生的原因
霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、 运输和储存期间生长并产生毒素 农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运 输过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭 受霉菌毒素污染
一、饲料中霉菌毒素的危害
3、霉菌毒素的种类
现已报道的霉菌毒素大约有300种 在饲料中常见的、对人和动物健康造成潜在 危害的毒素主要有：黄曲霉毒素、玉米赤霉 烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素和脱
饲料中霉菌毒素检测技术
交流提纲
一、饲料中霉菌毒素的危害
二、饲料中霉菌毒素的主要检测方法
三、ELISA法的操作要点及注意事项
四、 HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
质量第一 公正科学 及时准确
一、饲料中霉菌毒素的危害
1、什么是霉菌毒素？
霉菌毒素是霉菌产生的次级代谢产物
酵母
次 级 代 ห้องสมุดไป่ตู้ 产 物
抗生素
回形振荡混匀液体
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（6）读数（检测吸光度） • • 终止反应后应尽快检测吸光度 按照说明书要求设置酶标仪参数
三、ELISA法的操作要点及注意事项
3、其他应注意的问题
劳动安全保护及环境保护 不同批次的试剂盒微孔板不要混用
试剂盒质量差异（重复性、准确性）明显
知抗体
将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液
双抗体夹心法
相中的可溶性抗原
竞争法
将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗 体检测液相中的可溶性抗原或抗体
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、竞争 ELISA 的原理
三、ELISA法的操作要点及注意事项
枪头一次性使用
试样加入后的 步骤枪头不接触微孔 使用硅化枪头 高质量移液枪+配套墙头+人员操作训练 轻轻回形振荡
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（3）孵育 • • • • 孵育前应混匀反应物 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内液体挥发，加以密封
（4）洗板 甩除液体要干净利落，不要投鼠忌器
（2）加样
标准曲线孔--- 酶标抗原 + 标准曲线溶液 样品测试孔--- 酶标抗原 + 样品提取物溶液 注意事项：
加样体积准确
前后加样时间不宜过长 不可漏孔、跳孔 防止交叉污染
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项（续）
容易出现的问题 解决方法
一次检测不要检测太多样品 加样时间过长，导 致前后反应时间差 加样使用使用单枪，其他步骤使用排枪 异大 先将酶标抗原和样品提取液在空白微孔板中混合均 匀，再用多通道移液器将混合液加到检测微孔板中 交叉污染 液体挂壁排不尽 移取体积不一致 产生气泡
5、检测流程
取样
制样
GB/T14699.1 2005 饲料 采样
GB/T20195 动物饲料试样的制备
萃取 净化（主要用于色谱法） 分析测试
三、ELISA法的操作要点及注意事项
1、酶联免疫吸附（ ELISA ）试验的定义及分类
定义：用酶标记抗原或抗体检测液体中未知抗体或抗原的方法。 分类：
间接法
简单，只需萃取过滤 30-60分钟 多个样品，一个毒素
试纸条
简单，只需萃取过滤 5-10分钟 单种样品
仪器成本 准确度
检测成本 人员技术要求
昂贵（HPLC,LC-MS/MS） 高
昂贵 专业技术背景 复杂的培训
便宜 （酶标仪） 中
便宜 无需专业背景，简单培训
无需仪器 低
便宜 无需专业背景，简单培训
样品要求