定量蛋白组学
蛋白组学方法介绍
细胞破碎方法
2）剧烈裂解方法 (固体组织, 酵母菌)
• • • • •
超声裂解法 (Sonication) 弗氏压碎器（French press pressure cell） 研磨法（Grinding，mortar and pestle) 机械匀浆法（Mechanical homogenization） 玻璃珠匀浆法
基本原则： （1）全息性（keep all of protein information），尽 可能的制备所有蛋白； （2）样品制备的方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹 配，如采用双向电泳，需要谨慎使用SDS抽提蛋白质；如 果用液相色谱分离，不应该用太多的去污剂和两性电解 质(considering following protocols/kits ) ； （3）由于样品来源千差万别，针对不同来源的样品（如细 胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等），需要采 取不同的蛋白质抽提方法 (Different samples, different
基于胶染色和基于液相质谱联用 同位素标记和非同位素标记 体内标记和体外标记
二 双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的原理 双向凝胶电泳技术操作的基本过程 双向凝胶电泳的优缺点
1 常规双向电泳
• 一、双向电泳概述： 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋 白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳——等电聚 焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离， 第二向电泳——十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS—PAGE）利用蛋白质的 分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质， 凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和 含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、细 胞差异分析、药物开发、工业菌株生理比较等领域都得到了广泛的应用。 二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势： 1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料； 2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
定量蛋白质组学LC-MS-MS
百泰派克生物科技
定量蛋白质组学LC-MS-MS
定量蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分支，这个概念的提出使蛋白质组学的研究内容从定性向精确含量鉴定方向进一步发展。
目前，常用的蛋白质组学定量技术是基于质谱的技术，根据其是否使用同位素标记又分为标记策略（Label）和非标
记策略（Label Free），标记策略如TMT、iTRAQ和SILAC等。
LC-MS-MS即液相色
谱-串联质谱技术，是各种蛋白质质谱定量技术中所不可缺少的分析技术，也是实
现蛋白质定量的关键步骤。
其将经过不同标记或处理得到的蛋白肽段利用液相色谱进行分离后再进行多级质谱分析，根据肽段离子的质谱信号如离子峰强度等结合生物信息学分析手段计算各肽段的含量，从而实现整个蛋白质的含量鉴定。
百泰派克生物科技采用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC纳升色谱技术，提供高效精准的定量蛋白质组学LC-MS-MS服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析。
蛋白质组学的研究内容和意义
蛋白质组学（Proteomics）是在整体水平上研究细胞、组织或整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学。
其研究内容主要包括：鉴定特定细胞、组织或器官的蛋白质种类（蛋白质组全谱鉴定）、特定条件下蛋白质的表达量变化研究（定量蛋白质组学）、明确蛋白质在生命活动中执行的功能（功能蛋白质组学）、揭示蛋白质之间的复杂相互作用机制（相互作用蛋白质组学）、描绘蛋白质的精确二维、三维以致四维结构（结构蛋白质组学）、以及蛋白质翻译后修饰研究（修饰蛋白质组学）。
蛋白质组学的研究具有重大的科学意义和应用价值。
首先，蛋白质是生命活动的直接执行者，对蛋白质的研究有助于深入了解生命现象和疾病发生发展的机制。
其次，蛋白质组学研究可以提供大规模、系统化的蛋白质特性数据，以期望在蛋白质水平上解释控制复杂的生命活动的分子网络。
此外，蛋白质组学的研究对于新药研发、生物医药产业的发展以及重大疾病防诊治能力的提高具有重大的战略意义。
蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学的研究方法蛋白质组学是运用先进的分析技术，通过对细胞内的蛋白质分子进行检测、分离、同位素标记与定量等方法，研究不同细胞型、组织型、发育阶段以及病变状态等生物样本中蛋白质组成及其功能性调控的科学。
它是一门综合性学科，既涉及生物化学、蛋白质工程、分子生物学等学科，也涉及信息学及计算机科学等学科，运用了各种生物学技术和数学模型，将复杂的生物体蛋白质组织成一个有机的整体，从而更好地了解蛋白质的结构与功能关系。
蛋白质组学的研究方法主要包括：一、蛋白质分离与鉴定：蛋白质分离是蛋白质组学的基础步骤，其目的是从生物样本中提取蛋白质。
常用的技术包括凝胶电泳、膜分离、微萃取、液相色谱法以及离心分离等。
蛋白质分离之后，还需要进行鉴定，以获得蛋白质的名称及其细胞定位等信息，以便进行后续研究。
常用的方法包括凝集试验、蛋白质印迹、Western blotting、质谱分析以及二级结构分析等。
二、定量蛋白质组学：定量蛋白质组学是指利用有效的检测技术，对生物样本中的蛋白质进行定量分析，以便获得蛋白质组成及其功能性调控情况的精确信息。
定量蛋白质组学技术主要包括酶标记蛋白质定量、质谱定量以及流式细胞蛋白质定量等。
三、蛋白质组学的应用：蛋白质组学的研究结果可以用来研究基因调控、细胞信号转导、疾病机理等方面的问题。
它可以帮助研究人员更好地理解生物的复杂性，并为有效的治疗策略的制定提供重要的参考和指导。
它还可以用于研究新型药物的研究和开发，为疾病的治疗提供新的思路。
蛋白质组学的发展前景广阔，它不仅可以用于解决当前生物学上的实际问题，还可以为未来的研究提供重要的科学研究基础。
随着技术的进步和数据量的增加，蛋白质组学技术将会为生物学研究带来更多的惊喜和发现。
定量蛋白质组学的方法有哪些
定量蛋白质组学的方法有哪些？1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。
而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。
对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。
生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。
基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
2 方法学介绍目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRM HR)、和SW ATH。
简述如下：2.1 Label-freeLabel-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、重复性要求较高，准确性也较标记定量差。
因此，Label-free技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。
2.2 iTRAQiTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量准确，可同时对8个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
定量蛋白质组学分析方法
７ ２ ０・
色
谱
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第 ３ １ 卷
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２ 蛋 白质 组非标 记 （ １ ａ ｂ ｅ ｌ ｆ ｒ ｅ ｅ ） 定 量方 法 的研 究
相 对 于传统 的标 记 定 量方 法 ， 非标 记 定 量 方 法
不需要 在样 本分 析前 对蛋 白质／ 多 肽进 行标 记 ， 避免 了样本 标记 处理 环 节 造 成 的可 能 的样 品损 失 ， 在 检 测 肽段 的 数量 、 蛋 白质 的覆 盖 率 和 分 析通 量 方 面 具 有较 大优 势 ， 且 不受 样 品来 源 和数 量 的限制 ， 因而近
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蛋白质组学数据
蛋白质组学数据
蛋白质组学数据是指对组织、细胞或生物体内的蛋白质进行分析和研究所得到的数据。
蛋白质组学技术包括质谱技术、二维凝胶电泳技术、蛋白质微阵列技术等，可以得到蛋白质的序列、结构、定量等信息。
蛋白质组学数据可分为定量数据和定性数据两种。
定量数据包括蛋白质在不同条件下的表达量变化等信息，可以用于寻找蛋白质在不同生理和病理状态下的作用和调控机制。
定性数据包括蛋白质的标识和鉴定，可以用于研究蛋白质相互作用、代谢途径等方面。
目前，蛋白质组学数据在生命科学、界面科学、医学等领域都得到了广泛的应用，可以为疾病的诊断、预防和治疗提供重要的依据。
标记定量蛋白质组学
标记定量蛋白质组学
标记定量蛋白质组学是一种用于分析生物样本中蛋白质表达水平的技术。
它通过使用稳定同位素标记的氨基酸来对蛋白质进行标记，然后利用质谱技术对标记的蛋白质进行定量分析。
标记定量蛋白质组学的基本原理是利用稳定同位素标记的氨基酸（如 13C、15N 等）来替换蛋白质中的某些氨基酸。
这些稳定同位素标记的氨基酸在生物体内代谢过程中不会发生明显的化学变化，因此可以用来追踪和定量蛋白质的表达水平。
在实验过程中，将不同处理条件下的生物样本分别用稳定同位素标记的氨基酸进行培养，使蛋白质中的某些氨基酸被标记。
然后将这些样本混合在一起进行蛋白质提取和质谱分析。
在质谱分析过程中，标记的氨基酸会产生不同的质量数，通过比较不同质量数的蛋白质丰度，可以定量分析不同处理条件下蛋白质的表达水平差异。
标记定量蛋白质组学技术具有高灵敏度、高准确性和高通量等优点，可以同时定量分析大量蛋白质，并且可以检测到低丰度的蛋白质。
它已经被广泛应用于生物医学研究、药物研发、生物技术等领域。
蛋白组学定量蛋白质组学.ppt
2
常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
10
（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
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MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
32
MCAT策略流程：定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
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羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
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缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学是一门研究蛋白质组含量及其变化的学科。
百泰派克生物科技提供基于质谱的定量蛋白组分析服务。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学，就是对一个基因组表达的全部蛋白质或者一个复杂混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量与鉴定。
定量蛋白组学是蛋白质组学研究的一个重要分支。
蛋白质的表达水平与生命活动息息相关，因此对蛋白质进行定量分析对阐明蛋白质的生物学功能和细胞的各种生物进程十分重要。
定量蛋白质组学研究技术
现在常用的蛋白质组定量的方法根据定量手段的不同可以分为荧光定量技术、蛋白质芯片技术和基于质谱的定量技术。
荧光定量技术是二维凝胶电泳技术与荧光染色技术相结合的一种技术，运用荧光染料标记蛋白质，在2D胶上进行分离和鉴定，按照荧光强度差异来比较蛋白量的变化。
蛋白质芯片技术是通过蛋白质芯片从待测样品中捕获配体后，利用激光共聚焦显微镜或质谱等检测技术进行蛋白质组定量分析的。
基于质谱的蛋白组定量技术通过比较具有相同离子化能力的蛋白或多肽的质谱峰强弱，可以对它们进行相对定量。
相对于其他技术，该技术不仅可以测定肽序列，而且可以准确定量蛋白质。
目前基于质谱的定量蛋白质组学技术主要分为标记（Label）和非标记的（Label Free）两大类，其中标记的又可分为体内标记（如SILAC标记）以及体外标记（如 iTRAQ、TMT 标记）。
定量蛋白质组学。
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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蛋白质质谱数据 绝对定量
基于MRM 的蛋白质组学实验流程
复旦大学
MRM 实验的设计、优化
1.目标蛋白质组的选择: 依据先前的实验或者是文献,以及 网络资源寻找赶兴趣的蛋白
2.目的肽段的选择：
（a）选择目标蛋白特有的多肽来监测 （b）离子化和碎裂好的肽段更易被检测，灵敏度高，优先选择 （c）确保所选的肽段的 m/z值与所用仪器质量范围相匹配 (6-20个氨基酸） （d）如果可能，尽量不要选用含有易被化学修饰或发生重排的氨基酸 (例如：M,C等）
Analytical Chemistry, 2004
复旦大学
2.基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质绝对定量
磷酸化肽 段混合物 BNPP (内标） BNPP: bis(4-nitrophenyl) phosphate 与磷酸化肽段性质类似
混合物
HPLC–ICPMS
HPLC–ESIMS
I31P
tret/min MS/MS
不足： 用含磷的化合物BNPP作为内标， 在质谱上的响应与肽段的响应 还是会出现细微的差别，从而 给该方法的定量带来误差。
Angew. Chem. Int. Ed. 2007
复旦大学
3.非同位素标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量
通过向样本中加入不同 浓度的标准人肌红蛋白 绘制标准曲线，曲线的 反向延长线与横坐标交 点的相应横坐标值即为 此方法测定的实际样本 中人肌红蛋白的绝对浓度
1053.6
1072.5764
1074.8
1089.5776
1096.0
100
1223.9
90
脱氨峰
80
70
% Intensity
60
50
40
30
蛋白质组学定量分析
蛋白质组学定量分析蛋白质组学定量分析蛋白质是生命的物质基础，是人类的第一营养素。
正常情况下，我们身体中约有20％-30％的蛋白质处于亚健康状态，即“营养不良”或“蛋白质缺乏症”，如缺铁性贫血、巨幼红细胞性贫血等，需要及时补充蛋白质以纠正贫血，预防疾病。
蛋白质在细胞中具有多种生物活性，参与细胞内各种生化反应。
比如肌肉收缩、神经传导、细胞间信息传递、激素的分泌和免疫应答等，以及调节机体代谢和提高免疫力等方面，均离不开蛋白质的功能。
人体中蛋白质总量约占人体重量的40％，是人体的支架和基石。
每天都有新的蛋白质加入到体内，它们是推动人体活动和保持健康必不可少的物质。
我们在食用蛋白质食品后，通过胃肠道消化吸收后进入血液循环系统，为组织细胞供给氨基酸、维生素和矿物质。
人体吸收的蛋白质不但数量变化很大，而且还包括了很多种氨基酸，所以可以说，蛋白质是一种全价的营养素。
多糖也是蛋白质复合体，主要成分为粘多糖，是一类重要的膳食纤维来源。
多糖是具有水溶性或者部分水溶性的单糖、双糖、寡糖等低聚糖类，以淀粉、果胶、树胶等最为常见。
有些多糖能直接作为食品添加剂，但多糖的添加一般不宜超过1%。
一些细菌与病毒的分子构造很特别，难以被人体消化吸收，因此容易残留于肠道、尿道、阴道等部位，而引发泌尿系统炎症、妇科炎症和男性前列腺疾病等。
细菌性疾病的发生是和我们日常的饮食习惯密切相关的，食用了被大肠杆菌、幽门螺旋杆菌等污染的食物，会增加患病几率。
另外，口腔清洁不彻底、牙龈肿痛、龋齿等问题都是导致慢性牙周炎、蛀牙的诱因。
每个蛋白质复合体都是由若干个氨基酸聚合而成的，氨基酸的含量决定了蛋白质的生理活性。
例如，赖氨酸能够通过调节蛋白质的摄入、输送、利用等达到抗脂质过氧化的目的。
赖氨酸也被称为人体必需氨基酸，是所有活细胞中含量最丰富的氨基酸。
因此，如果缺乏这种氨基酸，则会影响其他氨基酸在体内的吸收和代谢。
当然，我们日常食物中的蛋白质大都是混合氨基酸，所以一般不用担心营养不良的问题。
蛋白组学定量值得比较说明
蛋⽩组学定量值得⽐较说明1. Maxquant的iBAQ和LFQ，该⽤哪个？我们使⽤Maxquant做Label Free蛋⽩质组学定量分析的时候，在Maxquant的参数设置时，会遇到两个参数，LFQ和iBAQ，那么，选择哪个好呢？如果你都选上，在最终的proteingroups.txt中，会出现三列：Intensity、IBAQ、LFQ intensity，这三列中的数字，也就是蛋⽩的定量强度，并不⼀样，那么，到底那⼀列⽐较准呢？⾸先，让我们来看⼀下三者的计算原理是什么？> Intensity是将某Protein Groups⾥⾯的所有Unique和Razor peptides的信号强度加起来，作为⼀个原始强度值。
> iBAQ是在上⾯的基础上，将原始强度值除以本蛋⽩的理论肽段数⽬。
> LFQ则是将原始强度值在样本之间进⾏校正，以消除处理、上样、预分、仪器等造成的样本间误差。
假设有两个蛋⽩，A和B，A和B在样本中的量是相等的，也就是等量。
假设A的长度是10个肽段，B的是100个肽段，假设鉴定结果中，覆盖度都是30%，那么蛋⽩A的强度是3，B的是30,。
这时候我们对⽐⼀下，B是A的10倍，但是，A和B原本是相等，这样就存在较为严重的误差。
这时候，如果我们将其原始强度值除以理论肽段数⽬，A的强度变成了3/10, B的强度变成了3/10。
A = B，Perfect！上⾯就是IBAQ的原理和⽤处。
但是在定量蛋⽩质组学中，我们并不做蛋⽩A和 B之间的定量，假如你有⼀个药物处理前的细胞和药物处理后的细胞的对照型样本做的定量蛋⽩质组学实验，我们关注的蛋⽩A在处理前和处理后的变化，⾄于A和B之间的⽐值，并不重要。
所以，如果是样本内对⽐，当然⽤iBAQ，因为其表征的是蛋⽩的摩尔⽐值（copy number）。
如果是样本间对⽐，当然是LFQ（正式名称为MaxLFQ，也就是搜库结果中的txt⽂件中的LFQ Intensity）[1]当然，如果你执意要⽤iBAQ，你可以⼿⼯校准样本件误差，⽅法很简单：蛋⽩IBAQ值除以此样品所有蛋⽩的强度的和，计算⽐例（这也是组学中“等质量上样”和“等体积上样”的核⼼区别，等质量上样来看的是⽐例，但是计算⽐例是有压缩效应的）[2]。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学定量蛋白质组学hplc2-液色迷人蛋白质组学研究的核心内容是蛋白质的动态变化和动态行为，即蛋白质的动态表达、动态定位、动态修饰和动态相互作用等，最终的研究目的是以大规模的尺度研究细胞内蛋白质的功能，这种研究要走向成熟必然要脱离对蛋白质的简单鉴定，实现对蛋白质的表达水平及其存在形式变化的检测。
因此，定量技术应该说是整个蛋白质组学的精华部分。
而这种定量通常不必是检测蛋白质在细胞内的绝对含量，而只需对其相对含量进行定量即可。
目前，蛋白质组研究中应用的比较成熟和可信的定量策略和方法主要有两种。
一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量。
1、基于双向凝胶电泳及其染色的蛋白质组学定量技术建立在传统的双向凝胶电泳和染色基础上的定量方法，通过比较不同胶上蛋白质点的染色强度来进行相对定量。
现有的染色方法包括银染、考马斯亮蓝染色，还有最新的荧光燃料。
染色在显示蛋白质的存在的同时，还提供了其表达水平的信息。
传统的双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技术由O’Farrell和Klose等人于1975年建立。
第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing，IEF），使蛋白质根据等电点不同进行分离，第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），即将等电聚焦后的胶条放在SDS-PAGE上再根据蛋白质分子量不同进行电泳分离。
由于具有高分辨率的特点，双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。
现在的双向凝胶电泳技术第一向利用固相pH梯度（Immobilized pH Gradient，IPG）等电聚焦技术，具有上样量大、分辨率高、重复性好等优点，并且可以提供蛋白质的等电点（pI）和分子量（MW）数值信息，有助于蛋白质的鉴定，而且双向凝胶电泳胶上常见的isoform多是蛋白质翻译后修饰的结果，对于这些蛋白质点的分析有助于了解对蛋白质功能影响重大的翻译后修饰。
蛋白质质谱定性定量
百泰派克生物科技
蛋白质质谱定性定量
对蛋白质进行定性定量鉴定即对目标蛋白的种类和含量进行鉴定是蛋白质组学研究中最基本的研究内容。
质谱技术是目前常用的蛋白质组学分析技术，它基于蛋白肽段离子的质荷比（m/z）和离子峰强度信息可实现蛋白质的定性和定量鉴定。
在质谱分析中，蛋白质先被酶解消化为小分子的肽段，小分子肽段在离子源中电离成肽段母离子，再利用质量分析器检测肽段母离子的质荷比和离子峰强度。
将肽段离子的质荷比数据与理论数据库进行比较、匹配可以确定其分子质量，进而获得该肽段的氨基酸组成，通过各肽段之间的拼接最后确定完整蛋白的分子量和氨基酸组成信息以实现定性鉴定。
肽段母离子的浓度与样品量成正相关，样品量越多，其产生的肽段离子就越多，相应的离子峰信号强度就越大，因此可以利用离子峰信号强度进行蛋白的含量测定。
若引入已知浓度的标准品（内标肽）还可以对蛋白进行精确的含量测定。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质质谱定性定量鉴定服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
简述定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组（quantitative proteomics）是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。
蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重要影响。
例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。
发展至今，传统的基于双向电泳的2D和2D-DIGE技术正在逐渐被基于NanoLC-MS/MS的液质联用技术取代；后者需要的样品量更少（25ug蛋白），灵敏度更高（ng级），通量也更高（一次分析可以鉴定和定量超过5000种蛋白）。
定量蛋白质组学常见技术如iTRAQ/TMT、Label Free、三类定量方法，百泰派克均可为您提供服务。
在这里我们给大家简要介绍一下这三种定量蛋白质组学方法：iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。
该技术采用多个（2-10）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析，能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量，可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。
分析原理iTRAQ/TMT标签包括三部分，如下图：1. 报告基团（reporter group）：指示蛋白样品丰度水平。
2. 平衡基团（balance group）：平衡报告基团的质量差，使等重标签重量一致，保证标记的同一肽段m/z相同。
3. 肽反应基团（amine-specific reactive group)：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段。
来自不同样品的同一肽段经试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。
当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。
蛋白质组学的研究内容
蛋白质组学的研究内容蛋白质组学是研究生物体内蛋白质的全集及其功能的科学领域。
蛋白质是生物体中最重要的功能分子之一，参与了几乎所有生命过程，包括细胞机能、信号传导、代谢调控等。
蛋白质组学的发展为我们深入了解生物体的生理与病理提供了重要的手段。
蛋白质组学的研究内容主要包括蛋白质组的鉴定、定量和功能研究。
首先，蛋白质组学致力于全面鉴定生物体内的蛋白质。
通过使用质谱仪等高通量技术，可以对生物体中的蛋白质进行高效、高通量的鉴定。
这些鉴定工作能够揭示细胞中存在的各种蛋白质，为后续的研究奠定基础。
蛋白质组学还关注蛋白质的定量。
在生物体内，不同条件下蛋白质的表达量会发生变化，这种变化往往与生物过程的调控密切相关。
蛋白质组学通过使用定量质谱技术，可以对蛋白质的表达量进行精确测量。
这种定量工作可以帮助我们了解生物体在不同状态下蛋白质的变化规律，进而揭示生物过程的调控机制。
蛋白质组学还包括对蛋白质功能的研究。
蛋白质的功能多种多样，包括酶活性、结构支持、信号传导等。
蛋白质组学通过结合生物信息学和实验方法，可以对蛋白质的功能进行预测和验证。
例如，通过对蛋白质序列的分析，可以预测蛋白质的结构和功能域。
通过实验手段，可以验证这些预测结果，并深入了解蛋白质的功能机制。
蛋白质组学的发展对生命科学和医学研究具有重要意义。
首先，蛋白质组学为疾病诊断和治疗提供了新的途径。
通过研究蛋白质组的变化，可以发现与疾病相关的蛋白质标志物，为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
其次，蛋白质组学有助于揭示生物体内复杂的生物过程。
通过对蛋白质组的研究，可以了解蛋白质在细胞中的相互作用、信号传导等机制，进而揭示细胞的生理与病理过程。
此外，蛋白质组学还有助于开发新的药物靶点和治疗策略。
通过研究蛋白质组的变化，可以发现新的药物靶点，并开发相应的治疗策略。
然而，蛋白质组学研究也存在一些挑战和限制。
首先，蛋白质组学需要高度精细的实验技术和数据分析能力。
蛋白质组学的实验操作涉及到多个环节，包括样品制备、质谱测量等，需要研究人员具备专业的技术能力。
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定量蛋白组学：应用SILAC（稳定同位素标记法）研究和厚朴酚治疗肝癌细胞HepG22．1．前言定量蛋白组学：应用SILAC(稳定同位素标记法)研究和厚朴酚治疗肝癌细胞HepG2和厚朴酚是植物厚朴中主要的活性成分之一，分子式：ClsHl802，其结构式见Fig．2．1。
有研究认为给予厚朴酚对背部皮下移植及右后足跖移植均有抑制肿瘤增殖的作用，新生血管数也明显减少。
探讨厚朴酚对细胞增殖、诱导细胞凋亡的影响时发现，添加100 üM厚朴酚时可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。
并且，由于这种诱导细胞凋亡伴有caspasc活性增强，从而提示是caspas~依赖性途径。
上述结果表明，诱导肿瘤细胞凋亡的直接作用以及阻碍血管生成的间接作用参与了厚朴酚抑制肿瘤增殖的作用。
另有报道，厚朴乙醇提取物显著抑制肿瘤细胞侵袭，作用呈浓度依赖型，但不影响肿瘤细胞的生长，未显示细胞毒性作用。
浓度为loo p g／mL时显著抑制HT-1080细胞趋向性结合的能动性，不影响肿瘤细胞对基底膜的粘附作用。
经鉴定该提取物中化学成分为厚朴酚、和厚朴酚，所含浓度分别为3．36％和4．3l％，表明该提取物的抑制作用与厚朴酚及和厚朴酚有关n[14-17]。
国外研究发现，厚朴酚有剂量、时间以依赖性地抑制人类HL260细胞和白血病JurkatT细胞的作用，这种作用与诱导细胞凋亡有关，并且发现厚朴酚诱导凋亡作用可以被凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-2抑制剂减弱，另外发现胞浆细胞色素C升高[18]’。
和厚朴酚能够诱导RKO细胞的凋亡。
对SVK血管肉瘤细胞也表现出诱导细胞凋亡的作用。
2002年的一项研究发现：BcI-XL的下调，线粒体细胞色素C的释放和caspase-3的活化都参与了和厚朴酚在人的鳞癌细胞CH27中引起的凋亡过程。
我们知道肝纤维化治疗的目标就是期望能够逆转纤维化，并且通过诱导细胞凋亡选择性地清除活化了的星形细胞。
Park 等人的研究发现[57]和厚朴酚能够诱导鼠活化的星形细胞凋亡，同时对肝细胞的存活能力没有影响。
Battl~等的研究也证实对于B细胞性慢性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞。
和厚朴酚可以作为一种具有潜能的凋亡诱导剂。
Hib~sAmi等人的实验则发现对于人的淋巴系白血病Molt-4B细胞用和厚朴酚进行治疗可以产生生长抑制和诱导细胞凋亡的双重功效，在治疗后的细胞中可以看到有凋亡小体存在的形态学改变。
Fig.2.1 和厚朴四化建设结构式蛋白质组通常定义为一个基因组、一种生物或一种细胞／组织所表达的全套蛋白质。
由于剪切方式的变化和翻译后的修饰，使得蛋白质组研究比基因组更加复杂，增加这种复杂性的另一因素是蛋白质丰度随环境变化而变化，即蛋白质为适应环境自身长期进化或环境应激而发生的改变[1]。
通过了解这些功能活动变化的过程，或许可以揭示为什么“健康”细胞有别于“疾病"细胞和细胞为什么有不同的行为方式。
蛋白质组学研究的一项关键内容，是在对比环境下对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析，通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异，进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病，从而确定多种致病因子在对机体作用时最重要的靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据[2]’。
过去，主要采用二维差异凝胶电泳(DIGE)技术分析蛋白质的差异表达。
近年来发展起来的一种稳定同位素标记(Stable~sotope Labeling) 质谱分析技术，因其使用稳定同位素标记，使得质谱检测更具特异性，加之质谱分析固有的准确性和采用束流检测后的高度灵敏性，使其在低丰度蛋白质的分析中展现出良好的应用前景[3-7]。
基于质谱技术，稳定同位素标记技术定量分析蛋白质表达水平获得了很大进展。
它是在两套对比标本中用同一核素的不同稳定性同位素标记蛋白或多肽。
通常是用富含某种重质同位素(比如：2H、13C、15N、18O)的试剂标记与被分析肽段相同的肽段作为其内标物，被分析肽段则与正常的同种试剂(即其中所有元素的含量皆为天然丰度)结合。
内标肽段与被分析肽段(组成为一个“分析对”)除了在质量上相差确定的几个单位外，其他的物理、化学性质几乎完全相同，在标记后的诸多分离纯化过程中，其行为很相似，由于质量数的差异，在质谱图上表现为一对峰，峰的间距由内标物所含的重质同位素的个数决定。
目前，各种不同的稳定同位素应用范围极广，而且在蛋白质组实验的不同阶段，它可以和化学方法或生物方法一起使用[8]。
1999年，cygi等建立了同位素亲和标签(isotope-coded affinity lag，ICAT)技术，为发展定量蛋白质组学提供了一个广阔的空间，ICAT试剂由3部分组成，既特异结合肽段中半胱氨酸残基的巯基、可引入稳定同位素的连接子和生物素(biotin)亲和标签。
试剂分为2种形式，分别被称为“重”质(连接子含有8个氘原子，D8)和“轻”质(连接子含有8个氢原子，DO)试剂；由8个氘原子与8个氢原子分别标记的ICAT质量正好相差80a。
ICAT技术在定量蛋白组学中广泛应用，但他也存在一些缺点：首先，这一方法无法分析不含半胱氨酸的蛋白质；第二，ICAT标记(一500 Da)在整个MS分析过程中保留在每个肽上，会影响肽段的检测和增加数据库搜索算法的复杂性，对一些小的肽段(小于7个氨基酸残基)更是如此，而对其二级质谱碎片离子解析增加了难度；第三，被标记的2个多肽相差8、含有2个半胱氨酸的多肽相差16时与氧化很难区分，对定量和鉴定都带来难度；第四，一般ICAT定量的误差在200以内，但如果样品成分复杂，定量误差会增大，并往往需要手工检查结果：第五，这种方法要获得完整的信息，最重要的是标记必须是特异、完全的，但当前标记的效率是时间依赖性的，很少能达到80％以上。
现在国外有许多报道另外一种定量蛋白组学的方法n耵：SILAC(stable isotopelabe~ing by amino acids in cell culture)。
用同位素标记必需氨基酸，将它加到缺乏此氨基酸的培养基。
用此培养基培养细胞，经过细胞代谢，标记的氨基酸融合到蛋白中，形成内码子。
此方法有许多优点：第一，SILAC不像ICAT有化学标记的参与；第二，SILAC省去了亲和纯化这一复杂的工作；第三，SILAC适用于几乎所有细胞的培养，包括原代细胞；第四，SILAC操作比较方便，并且相对比较便宜。
Fig.2.2 SILA技术与ICAT技术的比较国内外对和厚朴酚研究比较多，对于一些作用机制也做了了详细的研究，我们实验室也对和厚朴酚的治疗心血管疾病、抗肿瘤作用等做了大量的研究，但对于和厚朴酚具体的作用靶点还没有找到。
SILAC技术与质谱结合是一个很好的定量蛋白方法。
本文用和厚朴酚作用于亮氨酸一d3标记的肝癌HepG2细胞，提取蛋白，用质谱鉴定所有蛋白，以13-aetine蛋白为标准(因为13-actine是高度保守蛋白，不会被药物调控)，通过定量蛋白组学方法，确定出和厚朴酚调控的蛋白，根据蛋白功能及相关作用，找出和厚朴酚作用于癌细胞的作用机理。
2．2．实验材料2-2-1细胞株人肝癌细胞株HepG2由本实验室提供。
2．2．2试剂和材料所有氨基酸，包括同位素标记亮氨酸：均购自Sigma公司胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Tyrisin)：均购自美国Gibieo BRL公司。
蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail for use with mammalion call andtissue extracts)．购自Sigma-Aldrich公司。
蛋白质分子量标准品(Protein molecular weight marker)：购自MBI Ferment,as公司。
十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甘氨酸(Glycine)、TF．MED(N,N,N’N’-四甲基乙二胺)、'Iris碱(Tris base)、过硫酸铵、亚甲双丙烯酰胺、考马斯亮蓝19250(Coomassie brilliant blue(3250)、DTT(二硫苏糖醇)：均购自美国Bio-Rad公司。
培养基用抗生素：青霉素、链霉素为国产注射用药。
其他试剂均为进口或国产分析纯产品。
2．2．3实验仪器和设备低速离心机：Megafuge 1-0，Heraeus。
高速离心机：Centrifuge 5415D，Eppendorf。
高速低温离心机：AllegraTM 25R Cnatrifuge，BECKMAN COULTER。
超低温冰箱：MDF-792，SAra'O(-80'c)。
恒温培养箱：CChlncubator，SANYO。
恒温水浴箱：PolyScience 9505。
高压灭菌锅：LaboAutoelave，SANYO。
超净工作台：Biological Safety Cabinets，ClassⅡ，NUAIR，SANYO。
倒置显微镜：CK2，Olympus。
普通光学显微镜：CH-2，Olympus。
纯水仪：EAsYpurc UF 07412，Millipore。
pH计：DELTA 320 pH meter，METTLER TOLEDO。
超声破碎仪：Vibra cell TM，SONICS&MATERIAI S INC。
电子天平：PL2002，AB265-S，METTLER TOLEDO。
漩涡混合器：XW-80A Vortex，宁波新芝生物科技服务股份有限公司。
脱色摇床：WD．9405B，北京市六一仪器厂。
垂直电泳仪：Mini-PROTEIM 3 CELL，Bio-Rad。
凝胶扫描仪：GS-800 Calibrated Densitometer，Bio．Rad。
质谱仪：Waters-Q-TOF。
2．3实验方法：2．3．1实验流程图：Fig.2.3 实验流程图2.3.2 试剂配置2.3.2.1 细胞培养所需溶液的配制（1）细胞培养基：DMEM培养其按产品说明，常规过滤除菌后，加入抗生素：青霉素100U／ml，链霉素100U／ml，4"C保存。
(2)细胞保种液：DMSO与胎牛血清(FBS)按l：9混匀，- 20℃保存。
(3)0．25％胰酶消化液：0．25g胰酶溶解于100ml生理盐水，同时还可加入EDTA 0．02g，增强消化能力，常规过滤除菌，4℃保存。
2.3.2.2 SDS-PAGE和Western blot相关试剂和溶液的配制(1)Tris-甘氨酸电泳缓冲溶液：25 mmol／LTris base，192 mmoFL 甘氨酸(电泳级)，0．1％SDS，pH 8．3。
(2)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5％积层胶(2 m1)：蒸馏水1．4 ml，30％丙烯酰胺溶液O．33 ml，1.0mol／LTris(pH6．8)0．25 ml，10％SDS O．02 ml，10％过硫酸铵O．02ml，TEMED 0．002ml。