第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
第六章 微生物的生长及其控制1
获得同步生长的方法： 获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化化化化 物物化化
过过过 区区区区区区区区过 膜膜膜过
获得同步生长的方法主要有两类： 获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细 胞周期不同的周期变化。 胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 不影响细胞代谢。 不影响细胞代谢。
☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律， 论也基本适用于酵母菌。 论也基本适用于酵母菌。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 死亡的整个动态变化过程。 死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却 每种细菌都有各自的典型生长曲线， 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。
二、以数量变化对微生物生长情况进行测定 （一）直接法
将待测样品制成菌悬液，适当稀释， 将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方 格网的计数室内，在显微镜下直接计数； 格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的 体积一定， 体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个 数； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 要点：菌悬液浓度应在 个细胞/毫升左右 毫升左右； 要点：菌悬液浓度应在108个细胞 毫升左右；
第六章微生物的生长及其控制
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
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一些细菌的代时
菌名
培养基 培养温度 代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃ 17min
E. coli
牛奶
37
12.5
Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）
肉汤或牛奶 37
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
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（1）恒浊器 — 恒浊连续培养
Ø特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长 ，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺 复杂，烦琐。 Ø使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相 平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
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（二）指数期
1、特点： Ø 生长速率常数R最大，即代时最短; Ø细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致; Ø酶系活跃，代谢最旺盛。
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x2
2、指数期中的的
三个重要参数
x1
t1
t2
u繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
u生长速率常数R= u代时G=
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（三）稳定期
1、特点： （1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 （2）菌体产量达到了最高点。 （3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。 （4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢； （5）通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。
第六章微生物的生长及其控制
（2） 恒化器：
与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液 流速保持不变，并使微生物始终在低于最高 生长速率下进行生长繁殖的一种连贯培养装 置 在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增 长而增高，另一方面，限制因子的浓度会随 时间的增长而降低，（使菌体生长慢），两 者相互作用，会出现生长与流速相平衡，这 样，即可获得一定生长速率的均一菌体，又 可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定 菌体密度的菌体。
3、 防腐：（Antisepsis）
是指利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁 殖，从而达到防止食品等发生霉变的措施。
措施：
（1） 低温： （2） 缺氧： （3） 干燥： （4） 高渗： （5） 高酸度： （6） 防腐剂：
4、化疗：（Chemotheraph）
即化学治疗，它是利用对病原菌具有高度毒力，而对 宿主细胞无显著毒性的化学物质来抑制宿主体内病原 微生物的生长繁殖，借以达到治疗在目的。
连续培养的优缺点：
优点： A、高效，简化了装料、灭菌，出料、清洗等 程序。 B、产品质量较稳定。 C、自控，可利用各种仪表加以控制。 D、节约人力、动力、资源（水、汽等） 缺点： A、菌种易于退化 B、易遭杂菌污染。
第二节 影响微生物生长的主要因素
影响微生物生长的外界因素很多，除一些营养 条件外，还有许多物理条件，其中最重要的有 温度，PH、氧气等。 一、 温度： 微生物的生长T有宽窄，但总有最低生长T，最 适生长T，最高T。并称为生长温度三基点。 最低生长T：一般-5---10。C，极端为-30。C 最适生长T：嗜冷菌；中温菌；嗜热菌。 最高生长T：一般为80—95。C，极端为105— 300。C。
三、 影响加压灭菌效果的因素：
微生物的生长及其控制填空题1一条典型的生长曲线至少
第六章微生物的生长及其控制一、填空题1、一条典型的生长曲线至少可分为、、、四个生长时期。
2、根据微生物对氧气的需要可把微生物分为、、、、五种类型。
3、细菌生长的最适pH范围为，酵母菌生长的最适pH值范围为，霉菌生长的最适pH范围为，好气微生物生长的最适Eh值为。
4、中温微生物生长的最适温度为高温微生物生长的最适温度为，低温微生物生长的最适温度为。
5、巴氏消毒工艺条件为，实验室常用培养基灭菌工艺条件为，常压蒸汽灭菌工艺条件为。
6、加热是消毒灭菌中用得最广泛的方法，加热灭菌可分为__________和____________。
紫外线主要用于物体表面和空气消毒，这是由于它的______________________能力差。
7、影响微生物生长延滞期的因素有________、________、________、_________。
8、影响微生物耐热力的因素有__________、__________、__________、_________、。
9、影响微生物生长的物理因素除温度外，还有___________、____________、、等。
10、用血球计数板进行细菌计数所得细菌数中包含了_____________和____________两部分。
11、细菌总数测定方法可分为_________、__________、。
12、获得细菌同步生长的方法主要有（1）和（2），其中（1）中常用的有、和。
13、抗生素的作用机制有、、和。
二、选择题1、某细菌悬液经100倍稀释后，在血球计数板上，计得平均每小格含菌数为7.5个，则每毫升原菌悬液的含菌数为( )A、3.75×107个B、2.35×107个C、3.0×109个D、3.2×109个2、可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基为( )A、完全培养基B、基本培养基C、补充培养基D、鉴别培养基3、直接显微镜计数用来测定下列所有微生物群体的数目，除了( )之外。
06第六章 微生物的生长及控制
1. 微生物生长繁殖的pH值
大多数细菌、放线菌喜欢生活在中性偏碱的环境中， 细菌最适的pH在7.0~8.0之间，放线菌的最适pH在7.5~8.5 之间； 而酵母菌和霉菌刚好相反，适合在偏酸的条件下生 长，霉菌的最适pH值在4.0~5.8之间，酵母菌在3.8~6.0之 间。
2. pH值对微生物生长的影响
稀释倒平板法
操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！
2. 膜过滤培养法
菌数低的样品（如水）→ 膜过滤 → 培养 → 菌落计数
3. 显微镜直接计数法
缺点：
① 不能区分死菌与活菌 ② 不适于对运动细菌的计数 ③ 需要相对高的细菌浓度 ④ 个体小的细菌在显微镜下难以观察
4. 比浊法
5. 重量法
为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？
氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧 离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过 氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过 程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化 物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由 基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧 气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能 合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。
将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净， 然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其 干重。一般来说，干重约为湿重的10~20%，即 1mg干菌 = 5~10mg湿菌 = 4~5×109个菌体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6.氮量法(生理指标法)
微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以 常作为生长量的指标。如细菌含氮量约为菌体 干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白 质含量。
微生物学-第六章 微生物的生长及其控制
步骤：
菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜 培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始 洗脱液 后就可 以得 到刚刚分裂下来 的新生细胞， 即为同步培养。
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二、单细胞微生物的典型生长曲线
1.平板菌落计数法
最常用的活菌计数法。将适当稀释的菌液倾注平板 或涂布在平板表面，经适当温度培养后，以平板上出 现的菌落数乘以稀释度就可计数出原菌液的含菌量。 直径9cm 的平板上出现菌落数一般以50～500个为 宜。按照国家标准规定的样品菌落数总数测定的计数 原则，以平板菌落数在30～300个之间为报告依据。 适用范围： 中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微 生物。
生长曲线概念： 定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的 实验曲线，称为生长曲线。 生长曲线的制作： 把少量纯种单细胞微生物接种到一定体积的培养液 中后，在适宜的条件下培养，如果以细胞数目的对数 值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以绘制出分 批培养条件下微生物的生长曲线。
每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长 过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为 四个时期，即迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
技术要求： 样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操 作），严格无菌操作； 注意事项： 每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理， 倾注平板时的培养基温度； 误差： 多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样 品内菌体分布不均匀、以及不当操作。
2. 液体稀释法
对样品做10倍连续稀释，从适宜的3个连续稀 释度 中各取5ml 试 样，接 种 3组共9 支装有培养液 的试管中（每管接入1ml ）。经培养后，记录每个 稀 释 度 出 现 生 长 的 试 管 数 ， 然 后 查 M.P.N. 表 （most probable number，最大可能数），根据 样品稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。
微生物第六章总结
2.厌氧菌的液体培养：厌氧罐，厌氧手套箱。
二， 生产实践中培养微生物的装置
（一）固态培养法
1.好氧菌的曲法培养
通风曲：是一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业种广泛应用。
衰亡期的原因有：外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。
三， 微生物的连续培养
连续培养：又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养或密闭培养而言的。
1.连续培养的类型：（1）按控制方式分<1>恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养。<2>恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于某最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。
3.生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。
（三）稳定期：又称恒定期或最高生长期。特点是：生长速率常数R等于零，处在新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等。
1. 生长产量常数Y（生长得率）可表示菌体产量与营养物的消耗关系：y=x-x0/c0-c=x-x0/c0（x为稳定期的细胞干重g/mL，x0为刚接种时的细胞干重，c0为限制性营养物的最初浓度g/mL，c为稳定期时限制性营养物的浓度）
（2）按培养器级数分：单级连续培养器和多级连续培养器两类。
2.连续培养用于生产实践称为连续发酵。连续发酵与单批发酵相比优点是：（1）高效（2）自控（3）产品质量较稳定（4）节约了大量动力。缺点是：（1）菌种易退化（2）易污染杂菌。
第六章微生物的生长及控制答案
第六章微生物的生长及控制一、填空1. 研究细菌遗传、代谢性常采用指数生长期时期的细胞。
2. 用物理或化学方法杀死物品上大部分微生物的过程称消毒3. 防丄是采用一定方法阻止或抑制微生物生长，防止物品腐坏。
4. 干热灭菌的温度160C ~170 C、时间2h。
5. 影响微生物代时的主要因素有菌种、营养成分、营养物浓度和培养温度。
6. 影响微生物生长的主要因素有温度、ph、营养、02和水活度等。
7. 实验室常见的干热灭菌手段有烘箱内热空气灭菌和火焰灼烧;而对牛奶其他液态食品一般采用巴氏灭菌，其温度为60~65 C,时间为30min。
8. 通常，放线菌最适ph范围为7.5~8.5，酵母菌的最适ph范围为3.8~6.0，霉菌的最适ph范围为4.0~5.8。
9. 一条典型的生长曲线至少可分为延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个生长时期。
10. 试列出几种常用的消毒剂如苯酚、新洁尔灭、次氯酸和福而马林等。
11. 抗生素的作用机理有抑制DNA 复制、抑制蛋白质合成、抑制RNA 转录和抑制细胞壁的合成。
12. 获得纯培养的方法有：划线分离、平板涂布、显微镜直接挑取和浇注平板法等方法。
13. 抗代谢药物中的磺胺类是由于与对氨基苯甲酸相似，从而竞争性与二氢叶酸合成酶结合，使不能合成二氢叶酸。
14. 常用5~30%的盐渍腌鱼、肉，可久贮不变质的原因是高渗使细胞失水死亡。
15. 厌氧菌因为缺乏S0D，故易被02毒害致死。
16. 实验室活菌记数常采用菌落法、特殊染色法，总菌数记数常采用显微镜________板法。
17. 干热灭菌时必须在160C下维持2h时间才能达到彻底灭菌，一般根据是否能杀死芽孢制定灭菌条件的。
18. —般可通过机械筛选和环境条件诱导两类方法获得微牛物的同步牛长。
19. A..FIeming等发现了一种广泛存在于卵清、人的泪液等的一种酶溶菌酶仝能在水解细菌的细胞壁，水解为点是$1.4糖苷键。
20. 根据微生物生长与氧的关系，可以分为好氧彳________物三大类型。
第六章微生物的生长繁殖及其控制
第六章微生物的生长生殖及其操纵一、微生物生长生殖的概念微生物的生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。
当细胞个体生长到一定时期，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加即生殖。
在高等生物里这两个过程能够明显分开，但对低等特别是单细胞的微生物，由于细胞小，这两个过程紧密联系、特别难划分，因此，微生物的生长生殖，一般指群体生长，这一点与研究动物、植物有所不同。
1、细菌一般没有有性生殖，多采纳二分裂方式。
2、真菌除了进行无性生殖，产生大量孢子如分生孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子等外，还能进行有性生殖，产生有性孢子如卵孢子、接合孢子、孢囊孢子等。
二、微生物生长的测定微生物生长：单位时刻里微生物数量或生物量〔Biomass〕的变化个体计数微生物生长的测定：群体重量测定群体生理指标测定〔一〕以数量变化对微生物生长情况进行测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长或样品中所含微生物个体的数量〔细菌、孢子、酵母菌〕。
1、培养平板计数法样品充分混匀后，取一定量的稀释液涂布或倾注在平板上，进行培养，统计平板上长出的菌落数。
注重：1）同一稀释度三个以上重复,取平均值；2）每个平板上的菌落数目适宜，便于正确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，因此在科研中一般用菌落形成单位〔colonyformingunits，CFU〕来表示，而不是直截了当表示为细胞数。
2、膜过滤培养法当样品中菌数特别低时，能够将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。
3、Themostprobablenumbermethod〔液体稀释法〕1〕未知样品进行十倍稀释；2〕取三个连续的稀释度平行接种多支试管并培养；3〕长菌的为阳性，未长菌的为阴性；4〕查表推算出样品中的微生物数目；4、显微镜直截了当计数法采纳细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直截了当计数，计算一定容积里样品中微生物的总数量。
微生物学(周德庆版)第六章 微生物的生长及其控制
除不同种类微生物有其最适生长PH外，即使同一种微生 物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程，也有不同 的最适pH要求。研究其中的规律．对发酵生产中PH的控制极 为重要.
微生物细胞内环境中的PH值相当稳定.
41
4.2
7.0~7.5 9.3
Chlorobium limicola 泥生绿菌
6.0
6.8 7.0
Thurmus aquaticus 水生栖热菌
6.0 7.5~7.8 9.5
Aspergillus niger 黑曲霉 一般放线菌 一般酵母菌
1.5 5.0~6.0 9.0
5.0 7.0~8.0 10.0
19
应用意义：
1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上
应尽量延长此期，提高产量，措施如下：
• 补充营养物质（补料）
•
调pH
•
调整温度
2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。
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4、衰亡期
表现：出现 “负生长 ”，有些细胞开始自溶。
衰亡期特点：R为负值，细菌代谢活性降低，细 菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如 氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。 细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊， 有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。
42
不同微生物的生长pH值范围
微生物
最低
pH值 最适
最高
Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5
2.0~3.5 6.0
Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.0~4.6 5.8~6.6 6.8
第六章微生物的生长及其控制
第六章微⽣物的⽣长及其控制第六章微⽣物的⽣长及其控制1.概述⽣长:细胞物质有规律地,不可逆地增加,导致细胞体积扩⼤的⽣物学过程.繁殖:微⽣物⽣长到⼀定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定的⽅式产⽣新的⽣命个体，即引起⽣命个体数量增加的⽣物学过程。
⽣长是⼀个量变的过程，繁殖是⼀个质变的过程2.细菌的个体⽣长1.染⾊体DNA的复制和分离细菌的染⾊体为环形双链DNA分⼦。
染⾊体⼀双向的⽅式进⾏连续的复制，在细胞分裂之前不仅完成了染⾊体的复制，⽽且也开始了2个⼦细胞DNA分⼦的复制。
当细胞的⼀个世代即将结束时，不仅为即将形成的2个⼦细胞各备有⼀份完整的遗传信息，⽽且也具有已经按亲本⽅式复制的基因组。
其复制点附着在细胞膜上，随膜的⽣长和细胞分裂，2个未来的⼦细胞基因组不断地分离，最后达到2个⼦细胞中。
细菌在个体⽣长中通过染⾊体DNA的复制，使其遗传特性能保持⾼度的连续性和稳定性。
2.细胞壁的扩增细胞在⽣长过程中，细胞壁只有通过扩增，才能使细胞体积扩⼤。
3.细菌分裂的调节细菌进⼊分裂时期，此时在细菌长度的中间位置，通过细胞质膜内陷并伴随新合成的肽聚糖插⼊，导致横隔壁向⼼⽣长，最后在中⼼回合，完成⼀次分裂，将细菌分裂成2个⼤⼩相等的⼦细菌。
细胞在⽣长和分裂伴随细胞壁的裂解和闭合2个过程。
前者将细胞壁打开，有利于细胞壁物质插⼊；后者在新合成的细胞壁物质插⼊后的开⼝处重新闭合形成完整的细胞壁，以利于机体⽣存。
影响细菌的⽣长和分裂的主要因素是：转肽酶（催化2个肽聚糖的短肽链的链接）；D-Ala-D-Ala-梭肽酶（催化五肽转变为四肽）青霉素竞争性抑制转肽酶。
3. 细菌的群体⽣长繁殖1.⽣长的规律细菌以⼆分裂繁殖,即细胞核⾸先进⾏有丝分裂,然后细胞质通过胞质分裂⽽分开,形成2个相同的个体.分批培养:在封闭系统中对微⽣物进⾏的培养,既不补充营养也不移去培养物质，保持整个培养液体积不变的培养⽅式。
培养曲线：以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，依据不同培养时间⾥细菌数量变化，作出培养期间菌数变化规律的曲线。
微生物的生长及控制
生长曲线
02
二、单细胞微生物的典型生长曲线
生长曲线可分：
延滞期
对数期
衰亡期
稳定期
特点：
（一）延滞期（lagphase）
生长速率常数等于零； 细胞形态变大或增长； 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性； 合成代谢活跃； 对外界不良条件反应敏感。 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期、调整期。
可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。
通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子，控制生长速率；
恒化器（chemostat）
01
04
02
03
生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。 恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作：
繁殖代数（n）
繁殖代数 n=3.322 ( lgx2－lgx1)
1 2=21 2 4=22 4 8=23 8 16=24 16= 124 ………….. 2n x2= x1 2n lg x2 = lg x1 + n lg2 n = （lg x2 lg x1） / lg2 =3.322 ( lg x2 lg x1 )
01
02
个体生长→个体繁殖→群体生长 群体生长＝个体生长＋个体繁殖 在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义。 微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。
群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程，称之为发育。
2
3
1
微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。
第六章 微生物生长及其控制
第五节 有害微生物生长繁殖的控制
一、基本概念
防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止 或抑制霉腐微生物生长的一种措施 。比如:低温、缺氧、干燥、 高渗、高酸度、高醇度、加防腐剂等等。 消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所 有病原微生物的一种措施。比如：巴氏消毒法 灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内 的所有微生物的一种措施。包括杀菌和溶菌。比如：高压蒸汽 灭菌法 化疗(chemotherapy)：利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、 抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织、病变细胞进行治 疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无 毒害作用的治疗措施。以达到治疗传染病的目地。 四个概念的比较：p174表6-8
G = t1 - t0 /3.32(lgy - lgx) 特点：1）细菌个体形态、化学组成和生理特性等均 较一致2）代谢旺盛3）生长迅速、代时最短。 应用：研究微生物基本代谢、生理的良好材料。也常 在生产上用作种子
3.稳定期
表现： 新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态 平衡。 特点： 1）生长速率为0---动态平衡,细胞总数最高. 2）细胞内开始积累内含物 3）开始形成芽孢、次生代谢物 原因： 养分减少；有毒代谢物产生。 延长： 补料，调pH、温度等。
嗜冷微生物 兼性嗜冷微生物 嗜温微生物 嗜热微生物 超嗜热或嗜高温微生物
最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度
(二) PH
微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反 应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围， 在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微 生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适 生长的pH范围。
微生物的生长及其控制
微生物生长的测定：测定微生物的生长情况，可选用微生物的细胞数目或者生长量等作为指标。
测定细胞数目常用直接计数法、间接计数法以及其他计数法(比浊法和膜过滤等)；测定微生物的生长量常用测体积、称分量的直接法以及测含氮量、DNA 含量和其他生理指标的间接法。
同步生长：通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长。
获得微生物同步生长的方法主要有选择法和诱导法两大类。
典型生长曲线：单细胞微生物在分批培养时，其生长规律可用典型生长曲线描述，通常可分为四个时期：延滞期、指数期、稳定期和衰亡期。
研究和运用微生物生长规律对基础理论研究和指导生产实践都有重要的意义，连续培养的产生就是一例。
影响微生物生长的因素：影响微生物生长的环境因素主要是温度、氧气和pH。
根据最适生长温度的不同可将微生物分为三类：嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌。
根据微生物和氧的关系，可把它们分为专性好氧菌、兼性厌氧菌、微好氧菌、耐氧菌和(专性)厌氧菌五大类。
不同微生物有其生长的最适pH 范围；微生物生长会改变环境的pH 并导致对自身生长的不利状态，为此，在实验室或者生产实践中就应采用相应措施调整微生物培养物的pH。
微生物培养法：实验室和生产实践中培养微生物的方法和装置不少。
在实际工作中通常根据微生物的种类和培养目的等方面的不同进行选择。
微生物生长的控制：微生物研究或者生产实践中，往往需要控制所不期望的微生物的生长。
任何杀死或者抑制微生物的方法都可以达到控制微生物生长的目的，它们包括加热、低温、干燥、辐射、过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂、化学治疗剂等化学方法两大类。
灭菌：利用强烈的理化因素杀死物体中所有微生物的措施称为灭菌。
消毒：采用温和的理化因素杀死物体中所有病原微生物的措施称为消毒。
防腐：利用某种理化因素抑制微生物生长的措施称为防腐。
化疗：利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物或者病变细胞的治疗措施微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按其自身方式进行新陈代谢。
微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制一、名词解释生长:如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量就不断增加，于是出现了个体细胞的生长。
繁殖:如果这是一种平衡生长，即各种细胞组分是按恰当比例增长时，则达到一定程度后就会引起个体数目的增加，对单细胞的微生物来说，这就是繁殖。
生长限制因子:凡处于较低浓度范围内可影响生长速度和菌体产量的某营养物，就称生长限制因子。
活菌染色法:用特殊染料做活菌染色后再用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数方法。
菌落形成单位（cfu）:把稀释后的一定量菌样通过浇注琼脂培养基或在琼脂平板上涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个单菌落，此即“菌落形成单位”（cfu）。
同步生长:通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，成为同步生长。
同步培养:设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中。
生长产量常数:菌落达到稳定期时，菌体产量达到了最高点（如细菌一般每毫升可达109，原生动物或藻类为106个），而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系，这一比例关系为生长产量常数Y：x-x0 x-xY= ------ = ------C0-C Cx为稳定期细胞的干重，x0为刚接种时细胞干重，C为限制性营养物的最初浓度，C为稳定期限制性营养物的浓度。
恒浊器:是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。
恒化器:是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。
连续发酵:连续培养用于生产实践，就称为连续发酵。
嗜冷菌:喜好在温度小于20度下生存的菌，能忍受最低为-30度。
中温菌:喜好温度在20-45度的温度生存的菌，又分室温菌（约25度）与体温菌（约37度）。
嗜热菌:喜好在温度大于45度下生存的菌，能忍受最高为105-150度。
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第六章微生物的生长及其控制微生物的生长：在适宜环境条件下，微生物吸收营养物质，进行新陈代谢，有机体的各细胞组分协调而平衡地增长，为生长。
微生物的繁殖：单细胞微生物当细胞增长到一定程度时，就以二分裂等方式形成子细胞，引起个体数目的增加，为繁殖。
多细胞微生物唯有通过形成无性孢子和有性孢子等使个体数目增加的过程才能称为繁殖（细胞数目的增加若不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能称繁殖）。
微生物的发育：从生长到繁殖是一个从量变到质变的过程，这个过程就是发育。
个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法一、测生长量测定生长量（原生质含量的增加）的方法很多，适用于一切微生物。
（一）直接法1、粗放的测体积法2、精确的称干重法（二）间接法1、比浊法用分光光度计对无色的微生物悬液进行测定，不同浓度的菌悬液光密度吸收值呈线性关系。
常选450～650nm波段。
光束通过菌悬液时引起光的散射或吸收，从而降低透光度。
菌悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。
测定菌悬液的光密度或透光度即可反映细胞的浓度。
将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬液相比，可知前者所含细胞数。
2、生理指标法与微生物生长量相平行的生理指标很多：含氮量（细菌含氮量为干重的12.5%、酵母见7.5%、霉菌为6.5%,含氮量×6.25为粗蛋白含量）；含碳、磷、DNA、RNA、ATP、DAP、几丁质、N-NAM 及产酸、产气、耗氧、粘度、产热等。
二、计繁殖数单细胞状态的细菌和酵母菌要一一计算各个体的数目，放线菌和霉菌等丝状生长的微生物只能计算其孢子数。
（一）直接法用血球计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。
得到的数目是死、活细胞的总菌数。
特殊染料可将死、活细胞区分开，可用于活菌和总菌记数。
（二）间接法活菌计数法。
活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落。
常用菌落计数法。
1、平板菌落计数法可用浇注平板或涂布平版等方法进行，适用于各种好氧菌或厌氧菌。
菌落形成单位（colony forming unit，cfu）：一定菌样中的单个微生物经培养后，形成的单菌落。
根据每皿上形成的cfu数乘上稀释度即可推算出菌样的含菌数。
2、丝状真菌——霉菌生长的测定霉菌的生长表现为菌丝的伸长和分枝，可以其菌落的直径或面积作为生长的指标。
3、厌氧菌的菌落计数亨盖特滚管培养法。
半固体深层琼脂法——厌氧菌活菌计数。
第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长（一）微生物的个体生长微生物与其他个体一样，自小到大的生长过程。
（二）同步生长1、同步培养设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能的都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来了解单个细胞的的相应变化规律。
2、同步生长通过同步培养的手段使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态。
3、获得同步生长的方法（1）环境条件诱导法用抗生素抑制细菌蛋白质的合成；诱导细菌芽孢发芽；光合微生物的光照、黑暗控制；短期热休克；营养物质控制等。
（2）机械筛选法利用处于同一生长阶段细胞的体积、大小的相同性，用过滤法、密度梯度离心法、膜洗脱法收集同步生长的细胞。
★这种细胞在培养过程中，一般经2 – 3个分裂周期就会丧失其同步性。
二、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。
微生物的典型生长曲线：当把少量纯种单细胞微生物接种到衡容积的液体培养基中，在适宜的条件下培养，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。
如以细胞数目的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可画出一条曲线（延滞期、指数期、稳定期和衰亡期）。
微生物的生长数率常数：每小时分裂次数（R）。
（一）延滞期（停滞期、调整期、适应期）少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时间。
1、特点（1）R=0；（2）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状；（3）细胞内的RNA尤其rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；（4）合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶；（5）对外界不良条件（Nacl溶液浓度、温度）和抗生素等理化因素反应敏感。
2、延滞期出现的原因接种到新鲜培养液的种子细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物，需要有一段用于适应的时间。
3、影响延滞期长短的因素（1）接种令：接种物或种子的生长年龄（指某一群体的生长年龄）；（2）接种量：接种量的大小明显影响延滞期的长短。
发酵工业常采用种子：发酵培养基=1：10（V/V）；（3）培养基成分：应适当丰富，且发酵培养基成分尽量与种子培养基的成分接近。
（二）指数期（对数期）在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。
1.指数期的特点（1）生长速率常数R最大，细胞每分裂一次所需的时间——代时（G 世代时间、增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增间最短；（2）细胞进行平衡生长（菌体各部分的成分十分均匀）；（3）酶系活跃，代谢旺盛。
2．指数期中的3个重要参数（1）繁殖代数（n）（2）生长速率常数（R）（3）代时（G）3．影响指数期微生物代时长短的因素（1）菌种：不同菌种其代时差别极大。
（2）营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上生长时，其代时较短，反之则长。
（3）营养物浓度：营养物的浓度（浓度0.1~2.0mg/mL——2.0~8.0mg/mL时）既可影响微生物的生长速率，又可影响它的生长总量。
生长限制因子：较低浓度时可影响生长速率和菌体产量的某营养物。
（4）培养温度：温度对微生物的生长速率明显的影响。
4、实践意义指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是：（1）用作代谢、生理等研究的良好材料；（2）是增殖噬菌体的最适宿主；（3）是发酵工业中用种子的最佳材料。
（三）稳定期（恒定期、最高生长期）1．特点：（1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。
（2）菌体产量达到了最高点；（3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系（可用生长产量常数Y——生长得率来表示）；意义：消耗每g或mol营养物质所产生的菌体干重（g）。
（4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；（5）芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；（6）通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物（稳定期产物）。
2．稳定期到来的原因：（1）营养物尤其是生长是限制因子耗尽；（2）营养物的比例失调；（3）酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；（4）pH、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜；等等3．生产实践的重要指导意义（1）对以生产菌体或菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期；（2）是对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的最佳测定时期；（3）通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。
（四）衰亡期1．特点（1）R＜0，微生物的个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态（2）细胞形态发生多形化（膨大、不规则的退化形态）；（3）有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶；（4）有的微生物合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢；等等。
2．产生衰亡期的原因外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。
三、微生物的连续培养（开放培养）是相对于绘制典型生长曲线时所采用的单批培养（密闭培养）而言，为防止稳定期的到来而设计的一种培养方法。
（一）连续生长1、单批培养与连续培养单批培养微生物指数期后期时，一方面以一定速度流入新鲜培养基、通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，以同样的流速不断流出培养物。
容器内的培养物达到动态平衡，其中的微生物即可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，形成了连续培养。
2、连续培养的类型（1）按控制方式分1）恒浊连续培养根据培养器内微生物的生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体高密度、生长速度恒定的微生物细胞。
2）恒化连续培养设法使培养液的流速不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下达到连续培养。
（2）按培养器级数分1）单级连续培养某微生物代谢产物的产生速率与菌体生长速率平行，用单级恒浊连续发酵器进行研究与生产。
2）多级连续培养若生产的产物与菌体生长不平行，则根据两者的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置。
（二）连续发酵将连续培养用于发酵，即为连续发酵。
SCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。
四、微生物的高密度培养（高密度发酵）（一）高密度培养微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。
（二）应用用基因工程菌生产多肽类贵重药物（胰岛素、白细胞介素、干扰素、生长激素等）。
不同菌种和同种不同菌株间，达到高密度的水平差别很大。
E.coli可达174~175g(湿重)/L。
（三）高密度培养的具体方法1、选取最佳培养基成分和各成分含量主要营养物的抑制浓度，C/N是高密度培养的基础。
2、补料采用逐量流加的方式进行。
3、提高溶解氧的浓度可大大提高高密度培养的水平。
4、防止有害代谢产物的产生选用天然培养基、调整培养基的PH、调整培养温度、替换培养基成分等。
第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多，如：O2、温度、PH 值、水活度、渗透压、Eh、辐射、UV、电离辐射、超声波、化学药剂等。
一、温度1、生长温度的三基点任何微生物的生长温度有宽有窄，，可分为：最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。
（1）最低生长温度：一般-10—-5，极端为-30。
（2）最适生长温度（最适温度）：嗜冷菌：＜20（一般为15）。
中温菌：20—45，室温菌约25，体温菌约37。
嗜热菌：＞45，一般约50——60。
（3）最高生长温度：一般80—95，极端为105—150。
★宽温微生物与窄温微生物。
2、最适生长温度某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。
对同一种微生物，最适生长温度并非一切生理过程的最适温度。
如：产黄青霉的青霉素发酵30℃25℃ 20℃25℃0 h → 5 h → 40 h → 125 h → 165 h二、氧气1、微生物与氧的关系2、分子氧浓度和分压对三类微生物生长的影响3、5类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态4、O2对厌氧菌的毒害机制（1）生物体内，O2.-普遍存在在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构,及形成其他活性氧化物,对生物体极其有害.(2)SOD的抗氧机制(3)O2对厌氧菌的毒害机制凡严格厌氧菌无SOD活力,一般也无H2O2酶活力;所有具细胞色素的好氧菌都有SOD和H2O2酶;耐氧性厌氧菌不含细胞色素系统,但具有SOD而无H2O2酶。