小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

【目的要求】

1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。

2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点

【基本原理】

在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。

【实验用品】

1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等；

2．试剂0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI 溶液、Giemsa染液等。

3．材料：65-90天健康小鼠（生技09级72人，新华09生物技术36人，生科08级75人，生技08级70人，共253人，需购小鼠110只）

【方法与步骤】

1．前处理取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射2～6μg，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g的蟾蜍，若按4μg / g注射，需注射浓度为0.1％的秋水仙素溶液0.2 ml ）。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。

2．取骨髓细胞处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心5~10 min，弃去上清液。

3．低渗根据骨髓细胞液的多少，加0.075 mol / L的KCI液5～6 ml，在37℃水浴箱中或室温下低渗20～30 min。低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。4．预固定低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷Carnoy’s固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。然后以1000 r / min 离心8 min。

5．固定弃去上清液，加5～6 ml Carnoy’s液，轻轻吹打细胞，静置固定20 min。离心弃去上清液，再加5～6 ml Carnoy’s液，固定20 min。

6．制备细胞悬液离心弃去上清液，再加少许新鲜Carnoy’s固定液，用吸管将固定后的细胞吹散，并反复吹打混匀，制成浓集的细胞悬浊液。

7．准备载玻片滴片前1～2 h，将洁净的载玻片放在0～4℃冰水中，使其表面附有一层水膜。这样在滴片时，细胞悬液遇到载玻片上的冷水，染色体会迅速分散开来。

滴片法制备染色体标本

8．滴片取出预冷的载玻片，将其倾斜约30°放置。吸取细胞悬液，从距离载玻片40 cm 以上高度处滴至载玻片上2～3滴；滴片后立即用嘴或洗耳球对准滴片处轻微吹气；也可用镊子夹住载玻片、在酒精灯火焰上迅速过几下（见图），这样都有助于染色体分散和展开。9．干燥使滴片在室温下自然干燥，或在酒精灯火焰上烤干，也可用吹风机冷风吹干。10．染色待滴片充分干燥后，用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释的Giemsa染液（Giemsa原液：缓冲液＝1：10）染色30 min。然后自来水冲洗，空气干燥。镜检。

【结果观察】

1.在低倍镜下观察Giemsa染色后的中期分裂相形态。

2.选择分散适度不重叠染色体的分裂相，在高倍镜下进行观察。

3.观察小鼠染色体的端着丝粒的特征，识别着丝粒，染色单体，染色体，计算染色体数目，寻找雌雄小鼠之间在核型上的差别。

【作业】

交一张已染色的骨髓细胞染色体标本片，绘制图。

滩母羊促卵泡素受体FSHR基因PCR-RFLP分析

【实验目的】

1．熟悉PCR—RFLP分析技术原理及实验步骤。

2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。

3．了解PCR—RFLP在遗传病基因诊断中的作用。

【实验原理】

聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温(约93℃-95℃)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温(约50℃-70℃)下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70℃-75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n 倍,一般PCR经30-40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。

聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR-RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。

本实验以滩母羊外周血DNA为模板，PCR扩增促卵泡素受体FSHR基因的306bp特异片段产物，其中包含AluⅠRFLP多态位点，经AluⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度（243bp或193bp+50bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断滩母羊是否得到了带有缺陷FⅧ基因的染色体，从而做出间接基因诊断。

【实验用品】

1．DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）、10×PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶AluⅠ（20U/μl）、10×酶切缓冲液。

07级共134人，共需要TaqDNA聚合酶（250U）、dNTP（1ml）、限制性内切酶AluⅠ250U 三支试剂。

2．2%的琼脂糖凝胶、5×TAE、6×上样缓冲液、DNA Marker、Goldview染料。

3．PCR仪、凝胶成像系统、微量加样器（5μl、20μl、200μl）、枪头（20μl、200μl）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。

【实验步骤】

一．PCR反应

PCR反应体系20μl，其成分如下：