蛋白质测定方法之双缩脲法 Biuret法
实验一蛋白质含量测定
因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法
都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的
灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的
时间。
考马斯亮蓝法（Bradford 法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制 时间，即第 1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲，2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升 试剂乙，2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
O=C HN
R-CH O=C
HN R-CH
H2O
Cu H2O 紫色络合物
C=O NH
CH-R C=O NH CH-R
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸 成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的 物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先 画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的 顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光 度值。
Folin—酚试剂法实验表格：
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH21702NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定是我们判断每一种食物是否含有高蛋白，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的检测方法有一定的认识。
一般我们在生活中检查蛋白质含量的方法是通过硫酸铜的方法，也可以通过酚试剂的方法，所以大家觉得哪种方法比较方便，我们建议大家可以尝试一下文章介绍的方法。
双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似。
紫外吸收法较为灵敏50～100mg快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶;Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高～5mg慢速40～60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和phe还原硫酸铵;Tris 缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化。
考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5mg快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化。
硫酸铜法：称取0.2g硫酸铜，6g硫酸钾，把0.5g粉碎好的大豆(不用测量水分的)用滤纸包好放入定氮瓶中中，加20ml硫酸，(瓶口上放一个小漏斗，防止蛋白跑掉)小火在电炉子上消化，等没有碳化颗粒，并处于澄清状态时，拿下来凉一会。
再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止，再消化30分钟。
拿下来，等凉。
通过这篇文章对于蛋白质含量测定方法的介绍，我们应该都知道如何在生活检查蛋白质的含量，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的测定方法进行分析。
一般我们在生活中检测蛋白质的方法是比较多的，希望你们可以采纳文章介绍的方法。
BCA蛋白浓度测定方法
标准试管协议和微型版程序的稀释方案（活性范围=20-2000µg/mL）
管号 A B C D E F G H I 稀释液体积（µL） 0 125 325 175 325 325 325 400 400 BSA来源及体积（µL） 300的原液 375的原液 325的原液 175的B管稀释液 325的C管稀释液 325的E管稀释液 325的F管稀释液 100的G管稀释液 0 BSA终浓度 （µL/mL） 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0=空白
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
双缩脲法 （Biuret法）
紫外吸收法
较为灵敏 50～100mg
Folin－酚试 剂法（Lowry 法）
灵敏度高； ≈5mg
慢速 双缩脲反应； 硫酸铵；Tris 40～60分 磷钼酸－磷钨 缓冲液；甘 酸试剂被Tyr 氨酸；各种 钟 和Phe还原 硫醇
加强试管协议的稀释方案（活性范围=5-250µg/mL）
管号 稀释液体积（µL） BSA来源及体积（µL） BSA终浓度 （µL/mL）
A
B C D E F
700
400 450 400 400 400
100的原液
400的A管稀释液 300的B管稀释液 400的C管稀释液 100的D管稀释液 0
250
干扰物质
说明
费时 灵敏度低， 适用于0.2~ 8～10小 1.0mg氮，误 时 差为 ±2％
灵敏度低 1～20mg 中速 20~30分 钟 快速 5～10分 钟
将蛋白氮转化 非蛋白氮 为氨，用酸吸 （可用三氯 收后滴定 乙酸沉淀蛋 白质而分离）
测量蛋白质含量的几种方法以及优缺点
一、染料法
优点：因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
缺点：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
优点：方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。
其方法凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
四、紫外吸收法
优点：灵敏度高，仪器设备简单，操作简便。
缺点：准确度不高，有的检测不可用，有限制。
五、凯氏定氮法（Kjeldahl determination）优点：可用于所有食品的蛋白质分析中，操作相对简单费用低。
结果
准确、改进后可以用于微量蛋白质的测定。
缺点：最终测定的是总有机氮而不是蛋白质氮。
精确度低于双缩脲法、试剂有腐蚀性。
六、F olin－酚试剂法（Folin-phenol
Reagent Method ）
优点：灵敏度高，方便简单。
缺点：费时较长，精确控制操作时间
七、考马斯亮蓝法（Coomassie
brilliant blue staining ）
优点：灵敏度高，测定快速，应用广泛，只需一种试剂，用时间短。
缺点：有较大的偏差，而且去污剂等很多试剂对其有干扰。
经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介
充分混匀后, 室温下(20~25℃)放置30min
A540
（二） 绘制标准曲线
以每管蛋白的含量为横坐标,其相对应的A520为纵坐 标绘制标准曲线。
（三）未知样品蛋白质浓度的测定
取2只试管，每只分别加入1ml稀释的未知样品， 再分别加入4ml双缩脲试剂，操作方法同前。
然后，测540nm处光密度值，取其平均值。从绘 制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。
理和使用方法。
二、实验原理
2
2
2
180℃
加热
H－
＋ NH3
2
2
2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
O=C HN
H2O C=O
NH
含有两个或两 个以上肽键的
R-CH
CH-R
O=C
Cu
C=O
HN
NH
化合物均有双 缩脲反应
R-CH
CH-R
H2O
紫色络合物
➢ 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲 反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红 色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成 正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无 关，因此被广泛地应用。
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15 分钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时, 其max由465 nm 变为595nm
强碱性缓冲 液；Triton
X-100;SDS
最好的方法; 干扰 物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同 蛋白质变化
一、实验目的
➢掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理
和方法。
➢进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原
五、实验结果
Y×N
血清样品蛋白质含量 =
×100
生物化学实验2.双缩脲测定血清蛋白质含量
蛋白质是生命的物质承担者，要揭示生命 的本质，探讨各种生命活动的物质基础，就必 须对蛋白质的结构、性质和功能进行深入的研 究，这首先就需要将蛋白质分离出来，进行纯 化，再进一步进行测定。
蛋白质是是构成人体及动物细胞组织的重要成分，参 与机体内的各种生命活动
人体内蛋白质含量直接关系着人体的健康状况，测定 蛋白质含量在临床上尤为重要。
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
-
1 2 4 6 8 10
混匀后，37℃水浴中放置20分钟，然后在540nm波长 处，以空白管调零，在分光光度计上读取各管吸光度， 以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度（g/L）为横坐标，绘 制标准曲线。
实验步骤
2、样品测定
取2只试管，分别标上测定管和空白管，加入试剂
注意事项
加完试剂需要将试管混匀 注意水浴的温度及时间 分光光度计的正确使用
标准溶液
实验原理
绘制出蛋白质标准溶液的标准曲线：以吸光 度为纵坐标，蛋白质浓度（mg/mL）为横坐 标，绘制标准曲线。
在相同的实验条件下，测定未知蛋白质含量 的血清样品溶液，在540nm处的吸光度，查 标准曲线求得样品的蛋白质浓度（g/L）。
试剂和仪器
(一）试剂 1、双缩脲试剂：取3g硫酸铜，500mL蒸馏水 溶解，加9g酒石酸钾钠、5g碘化钾，加入 100mL6mol/L氢氧化钠，用蒸馏水稀释到 1000mL，贮存于塑料瓶中，避光保存。 2、0.9%（W/V)NacL溶液 3、小牛血清 4、蛋白质标准溶液
血清蛋白质中某些蛋白质含量的变化可以作为临床上 某些疾病诊断的依据
方 法 灵敏度 时间 原 理 干扰物质 说 明
凯氏定氮法 (Kjedahl法)
5种蛋白质分析方法
蛋白质分析方法1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1)2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
评价：总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——>蛋白质含量灵敏度低，误差大，耗时长。
2、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
蛋白质含量测定方法
蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
试剂与器材
1.试剂: (1)标准蛋白质溶液，用牛血清蛋白配制成
0.1 mg/ml (2)考马斯亮兰G-250染料试剂：称100 mg
考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙 醇后，再加入120 mL 85 %的磷酸，用水 稀释至1L。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.器材 (1)紫外可见光分光光度计 (2)试管8支
操作步骤
五种不同蛋白质含量测定方法的比较值得注意的是除凯氏定氮法外其余四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定有可能得出四种不同的结果
考马斯亮蓝法测定 蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
➢在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中，反应式为: (NH4)3SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
➢用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量 计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量，反 应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
蛋白质含量测定方法
蛋白质含量测定院系名称食品与生物工程学院学生姓名孙洪磊学号 2专业班级生工06 - 2指导教师马美范二○○九年四月一日蛋白质含量测定方法比较蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH21702NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
各种蛋白质测定方法比较
各种蛋白质测定方法比较蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。
没有蛋白质就没有生命。
蛋白质测定便是指通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定。
目前测定蛋白质的方法较多，此报告主要介绍凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法、考马斯亮蓝法。
凯氏定氮法（Kjeldahl determination）原理：蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
蛋白质含量=含氮量/16%。
优势：测定结果准确，重现性好。
缺点：操作复杂费时，试剂消耗量大。
应用范围：适用于0.2～1.0mg氮，误差为2%。
双缩脲法（Biuret method）原理：双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子发生双缩脲反应，形成紫色络合物。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
优势：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
应用范围：适用于1～20mg氮。
紫外吸收法（UV spectrography）原理：蛋白质分子中，络氨酸、苯丙氨酸、色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后，反应生成的颜色产物用紫外—可见分光光度计在280nm波长下测定吸光度。
将测得的值对蛋白浓度作图，得标准曲线。
未知样品做同样处理后，根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知样品的蛋白浓度。
优势：特异性、精密度好；呈色稳定性好，试剂单一，操作简便；不消耗样品，可以回收。
缺点：准确度差，干扰物质多。
应用范围：适用于50～100mg蛋白质。
稻米中蛋白质含量测定
实验二稻米中蛋白质含量的测定本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法，比较不同方法的测定结果的差距，知道稻米中蛋白含量的范围。
一、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成5mg/ml的标准蛋白溶液，牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N KOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以0.3克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和1.2克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用100毫升水溶解，在搅拌下加入60毫升10% NaOH溶液，用水稀释到200毫升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：可见光分光光度计、试管10支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取7支试管分两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，于550nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：称取被测样品（过100目筛）0.4000g，放入干燥的150ml三角瓶中，先加入1ml四氯化碳再加入50ml双缩脲试剂，盖上瓶塞，利用振荡器振荡5分钟后，再于室温下放置30分钟，取适量溶液倒入离心管中，在4000r/min 下离心10分钟，将澄清的上清液倒出，取3个试管，测定未知样品的蛋白质浓度。
蛋白质质量测定常用的方法
蛋白质质量测定常用的方法①凯氏定氮法原理：蛋白质平均含氮量为16%。
当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。
蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。
比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。
其精确度较差(数mg)，且会受样品中硫酸铵及Tris 的干扰，但准确度较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。
试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+，Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约0.1 mg)，但较麻烦，也会受硫酸铵及硫醇化合物的干扰。
步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）⑤色素结合法（Bradford 法）直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。
CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。
当CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。
蛋白质测定方法之双缩脲法Biuret法
一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以 1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
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一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl 配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以 1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。
三、Folin—酚试剂法（Lowry法）
（一）实验原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且
专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry 反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。
通常测定范围是20~250mg。
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B）0.5克硫酸铜（CuSO4?5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：
在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠
（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。
牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
2.器材
（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升
试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。
全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。
待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。
每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。
表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。
最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。
即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。
如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。
因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。