DNA和RNA提取方法及原理

针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理
核酸分离、纯化
多糖的去除：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。


根据核酸分离纯化方式的不同有：
吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• • •
阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
浓盐法：
RNA提取专题
第一部分：RNA提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析
分离提纯RNA的目的

分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物
RNA的不稳定性
由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易 于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复 活性，不易失活


沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有 利于充分沉淀
沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等


晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）
若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
• •
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μ L DNA液中加入 200μ l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
核酸分离、纯化
多酚的去除：
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

• • • • •


变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断
复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染 G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁

核酸分离、纯化
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取

采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
源自文库

根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离

有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用

密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来
的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和
多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
RNA提取专题
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。

注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
• 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法


CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
第一部分：RNA提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析
RNA提取的步骤
材料的裂解
异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇， N-月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复 合物变性，释放RNA，有效抑制核酸 酶。 苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物， 使DNA及蛋白沉淀到有机相。
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）





含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集

细胞裂解
基因组DNA的提取
保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染
DNA提取的几种方法


染色体DNA的提取
CTAB法 SDS法
其它
DNA提取的几种方法
非染色体DNA的提取 质粒DNA的提取
DNA提取常见问题
问题三：DNA提取量少。 原 因
1.
1. 2.
实验材料不佳或量少
2.
3. 4.
破壁或裂解不充分
吸附或沉淀不完全 洗涤时DNA丢失
对 策
3. 4.
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁。高温裂解 时，时间适当延长（对于动 物细胞、细菌可增加PK的用 量）。 增加吸附的时间，或低温沉 淀 小心操作
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取及常见问题分析
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解

CTAB提取缓冲液的改进配方
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
植物材料
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
常用RNA酶抑制剂
焦磷酸二乙酯（DEPC）： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结 合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。 异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使 RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA酶有强烈的变性作用。
氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和
基因组DNA的检测
提取的基因组DNA片段在20kb－30kb之间
高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象
DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL 双链DNA；
A260/280 约为1.8
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因
1. 2.
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液
溶液III中和
离心洗涤
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡
质粒DNA的提取


菌体量适当
培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。 原 因
1.
2.
1. 2. 3.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 对 酶的活性 提取过程操作过于剧 策 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
4.
5.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
提取RNA的注意事项
经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。
使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。
应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β -巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
盐离子的去除：
70％的乙醇洗涤
核酸沉淀、溶解
基因组DNA的提取

质粒DNA的提取
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
DNA和RNA提取 常见问题分析及对策
DNA提取专题
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题分析及对策
前言
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为 了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子 量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
DNA提取原则
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。

差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
3.
4.
DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 DNA中残留有金属离 子 有RNA的存留
1.
对 策
2. 3. 4.
重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70％乙醇洗涤的 次数（2-3次） 加入RNase降解RNA