引物设计及测序结果分析

5′···GCAGUACAUGUC ···3′
翻译
mRNA
N· · · · · · Ala · Val · His · Val · · · · · · C
蛋白质
PCR 模板:cDNA
CDS（coding sequence）是编码一段蛋白产物的DNA序 列。一般以ATG开始，以TAA、TAG、TGA结尾。 cDNA （complementary DNA）是与RNA链碱基互补的 单链DNA，或此DNA链与其碱基互补的DNA链所形 成的DNA双链。
3.1 引物设计
（primer design）
引物的定义
引物（primer）是一段短的单链DNA或RNA片段，可结合在
DNA模板链上与之互补的区域，作为DNA复制的起始点。
体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(Polymerase
Chain Reaction，PCR )、测序和探针合成等。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（1）
MⅡ
61
63
65
NC
1200bp 900bp 700bp 500bp 300bp 100bp
DNA模板链、编码链与转录及翻译的关系 5′···GCAGTACATGTC ···3′ 3′··· c g t c a t g t a c a g ···5′
反转录 转录 编码链(CDS) 模板链
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/19881396?from=455&to=3 511
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/19881396?report=fasta&from=455&to= 3511
将查找到的CDS序列以.txt文件保存
将查找到的CDS序列以.seq文件保存
将查找到的CDS序列以.seq文件保存
（二）序列同源性比较
1、利用在线的NCBI中的BLAST工具进行比较 2、利用DNAman等软件进行多序列比较
序列比对
参数一般默认
序列比对结果
（三）引物设计与筛选
1、利用Primer Premier 5.0 软件设计引物，扩增BPMV CP 基因片段。
MⅡ 57
63
65
57
65
NC
Target segment: 813 bp
900bp 700bp
←dimer
7、引物的GC含量
G+C含量以40-60%为宜。 G+C太少，PCR扩增效
果不佳；G+C过多，易出现非特异条带。
8、引物的Tm
合理的退火温度为55～70℃
两引物的Tm 值相差不应大于5℃
产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度,使PCR反应不能正常 进行。
hairpin
引物自身形成二聚体（self-dimer）
Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5 Forward primer: 5 AACCTCTCGCTGCAGTTCTTCC 3 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA 5
构时要加上它们。
三、引物设计软件
常用引物设计软件：
Primer Premier 5.0 Primer 3
DNAman
Oligo 6（引物评估软件）
（一）序列查找和下载
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_003495.1
引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到
PCR的特异性和实验能否成功。
PCR的基本原理
三步循环：变性、退
DNA模板
95℃（解链）
火、延伸������
1.变性：双链DNA解
链成为单链DNA ������
2.退火：部分引物与
DNA单链
60℃（退火）与引物结合 Reverse primer Forward primer 72℃（延伸） Taq酶，dNTPs,
Load sequence
Primer Premier 启动界面
导入已知的BPMV CP基因的CDS(coding sequence)序列 note：存储的文件 路径及名称不能含 有中文。
Press OK
序列导入结果显示窗口
在目的序列的第一个 碱基处双击
Genbank窗口
点击“primer”按钮
4、引物的碱基分布
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷
酸的成串排列。
引物3＇端的碱基分布
引物3＇端最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对
引物3＇端最好以C或G结尾，避免使用A 引物3＇端避免出现3 个以上连续的C或G,如GGG 或CCC 引物3＇端5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ碱基G+C不宜超过3个
一、引物设计流程
序列查找和下载 序列同源性比较
引物设计与筛选
引物加工与修饰
引物的评价分析 引物的二次筛选
引物的最终评估
二、引物设计原则
（一）基本原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体(dimer)
或发夹结构(hairpin)
引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反
物及扩增基因长度，附上引物设计窗口和引物数 据库窗口图。
考核操作题（一）
自行在NCBI核酸数据库内检索一个基因CDS序列(长度
大于500bp)，完成下列操作（10分）。
① 将查找到的CDS序列以“基因登陆号.txt”文件保
存
② 设计一对引物扩增此基因片段，要求在搜索标准
窗口设置PCR扩增产物长度为200～500bp。
③ 新建一个word文档，报告引物搜索结果的第1#引
模板的单链DNA的 特定互补部位相配对 和结合
3.延伸：以目的基因
Mg2+
为模板，合成互补的 新DNA链
PCR Rrimers
5
CACTACAAGGACTGCCATGAG ATTTCAGTGGCACCTGCCTGG TAAAGTCACCGTGGACGGACC 5
3
5 CACTACAAGGACTGCCATGAG 3
GTGATGTTCCTGACGGTACTC TAAAGTCACCGTGGACGGACC
5
Forward primer/sense primer: 5 CACTACAAGGACTGCCATGAG Reverse primer/anti-sense primer : 5 CCAGGCAGGTGCCACTGAAAT
5、引物的ΔG值
∆G 值是指DNA双链形成所需的自由能，反映了双链结构内部碱基
对的相对稳定性。 3 ‘端∆G 值应较低，否则易引起错配。
6、引物的互补情况
引物自身及引物之间不宜存在互补序列。如果引物自身折叠成发
夹结构（Hairpin），会因空间位阻而影响引物与模板的结合。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5Kcal/mol）,易导致
上下游引物之间二聚体（cross dimer）
Reverse primer : 5 CTGTGCTCTCTCATCATCATATTC Forward primer: 3 CCTTCTTGACGTCGCTCTCCAA
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（2）
Gill 59 61 Kindey 59 61 63
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
退火温度=Tm值-5℃
9、引物的修饰情况
引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光
、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插 入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
在计算Tm值时不必考虑附加序列，但在检测互补及二级结
应(即错配)
（二）一般原则 1、引物的长度 一般15～30bp，常用18～24 bp。
引物过短容易引起错配现象，引物过长会导致PCR延伸温度大于
74℃，不适于Taq DNA聚合酶。
2、引物扩增跨度
即产物长度，以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长
至10kb的片段。
3、引物的特异性
在模板cDNA的保守区内设计引物。 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
点击“search”按钮
引物搜索选项设定
Press “OK”
搜索结果
Press “OK”
搜索结果窗口
点击选中一对引物
引物设计窗口
挪开“Search Results”窗口
引物数据的保存
引物数据库窗口
3.引物已输入到
数据库中
2.点击“Export”
1.按“Ctrl”，选择引物
引物合成订单
选择引物，点击菜单栏“Function”→ “order form” → “new form” ,弹出 “Synthesis order form”窗口