生物素-亲和素PPT资料24页
生物素亲与素系统有关技术课件
活化生物素可与不同的大分子物质结合， 应根据可标记基团的种类及特性，选择 相应的活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素
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一个蛋白质分子可联结多个生物素分子， 即生物素化大分子具有多价性，它是 BAS多级放大作用的物质基础。
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一）生物素及活化生物素
(一)生物素
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分 布的一种小分子生长因子，又名辅酶R 或维生素H。
2.分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
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3.结构： 结合亲和素
咪唑酮环
结合蛋白质
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+A-E
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3 ABC法：
⑴ A+B·☼
⑵ Ag+Ab·B ABC
A- B·☼ ----------ABC
Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-
特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB
法中的A先与B-E结合，制备成复合物
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+ B-E + A
ABC
PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检 测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异 性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接 分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检 测抗原使敏感性生物高素亲于与素E系L统I有S关A技和术课R件 IA。
免疫-PCR
一、主要程序
1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗 体复合物；
+ABC
ABC法在夹心ELISA中的应用 生物素亲与素系统有关技术课件
亲和素和生物素
亲和素和生物素：两种重要的生物学试剂一、亲和素亲和素是一种重要的生物学试剂，它是一种结合蛋白质的小分子化合物。
亲和素可以通过特定的化学反应与蛋白质结合，从而用于分离、纯化和检测蛋白质。
亲和素的结合能力基于亲和素与蛋白质之间的特异性相互作用，这种相互作用可以形成强大的结合力。
亲和素在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 分离和纯化蛋白质：亲和素可以用于分离和纯化具有特定结构或功能的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。
2. 检测蛋白质：亲和素可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。
3. 蛋白质互作研究：亲和素可以用于研究蛋白质之间的相互作用，例如酶底物、受体配体等。
二、生物素生物素是一种水溶性维生素，也是一种重要的生物学试剂。
生物素可以与亲和素结合，形成亲和素-生物素复合物，从而实现对蛋白质的分离、纯化和检测。
生物素在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 蛋白质标记：生物素可以用于将生物素结合在蛋白质上，从而实现蛋白质的标记。
这种标记可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。
2. 细胞标记：生物素可以用于将生物素结合在细胞表面上，从而实现对细胞的标记。
这种标记可以用于研究细胞的生理和病理过程。
3. 蛋白质互作研究：生物素可以用于研究蛋白质之间的相互作用，例如酶底物、受体配体等。
三、亲和素和生物素的结合亲和素和生物素的结合是一种特殊的相互作用，它可以形成亲和素-生物素复合物。
这种复合物在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 亲和素-生物素标记法：亲和素和生物素的结合可以用于将生物素结合在蛋白质上，从而实现蛋白质的标记。
这种标记可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。
2. 亲和素-生物素分离法：亲和素和生物素的结合可以用于分离和纯化具有特定结构或功能的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。
9章生物素亲和素
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附
AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质
BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）
BAS技术基本类型
BAB法
（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节
生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构
生物素-亲和素共25页PPT
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11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
生物素－亲和素
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
生物素-亲和素标记技术
食安0501 类春燕 孙隽 陈春艳
孙晓丽 李臻佳
➢基本原理
生物素与抗体共价交联的方法简单，条件 温和，且一般不影响抗体的活性。生物素 与亲和素能快速结合，而且反应不受外界 干扰，具有高度特异性和稳定性，两者的 亲和常数比抗原－抗体反应高10－100万倍， 结合快，呈不可逆反应，而且在pH，温度、 有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能 稳定存在。
✓每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
✓双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测 相思子毒素
✓用亲和素-生物素ELISA检测GPV抗体 ✓生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定
双酚A
2. BA-分子生物学技术
将引物生物素化，经过PCR反应后,用(链霉)亲和素 固定扩增产物，进行下一步的显色或荧光等检测。
6. BA-分离提纯技术
待分离物生物素化，结合于亲和素包被的固相载体上， 洗脱后，达到分离提纯的目的。
۞ Morag G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
07 生物素-亲和素
特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子 可结合4个生物素分子。 亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应， 但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于 多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响， 故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
Ag+B· Ab Ag-Ab· B
亲合素(A)
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
底物
酶标生物素
生物素化的抗体
+A
+A
BA法（标记亲和素-生物素法）
生物素亲和素
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP
亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
生物素-亲和素免疫放大技术
第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。
二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。
（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。
（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。
标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。
2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。
3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。
亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。
四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。
生物素亲和素
生物素亲和素
生物素亲和素，俗称配体，是一类高度特异性的小分子，对其结合的物质有着极强的亲和力，并发挥着重要的生物作用。
配体存在于各种生物体中，如蛋白质、糖原、细胞膜等，可以作为特征原件，帮助识别物质、发挥调节作用，并完成许多关键生物功能。
一般情况下，生物素亲和素都具有一定的大小和结构，通常由一系列简单的有机分子组成，它们之间经过疏水引力、电荷、静电吸引力和化学键，起着结合蛋白质并维持空间结构的作用。
特别是在酶反应中，配体紧紧地包裹住酶的活性位点，使其高度特异性。
同时，生物素亲和素也可以作为药物和靶向治疗药物的结合体。
靶向治疗药物是一种具有选择性结合靶细胞的药物，其中的配体可以靶向结合靶细胞的分子表面标志，从而阻断或促进细胞的特定水平，从而改变疾病的发展状态。
生物素亲和素在医学领域也有很重要的作用，它可以作为能够识别特定抗原的特异性抗体，把特定抗原和对应的宿主机体特异性细胞结合在一起，从而触发免疫反应并改变疾病的发展状态。
此外，它同样可以作为诊断试剂，帮助医生快速检测超痕量标记物，更好地识别患者的病情。
总之，生物素亲和素是一种重要的生物物质，在许多关键生物功能的完成与调节中发挥着重要作用。
它的功能可以从简单的结合物质到复杂的免疫识别，以及医学诊断等方面，都发挥着至关重要的作用。
因此，研究和发展生物素亲和素，将有助于开发更加高效的药物和诊
断试剂，以帮助人们更好地控制和治疗疾病。
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A
二）亲和素和链霉亲和素
❖(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：
1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。
2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙
氨酸含量较大 。
4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
BA法在间接ELISA中的应用
+A-E
3 ABC法：
⑴ A+B·☼
⑵ Ag+Ab·B
A- B·☼ ----------ABC
Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC
特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中 的A先与B-E结合，制备成复合物ABC； 操作比BAB法简便，但仍然保持较高的 灵敏度。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量 地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和 特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通 过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由 此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
免疫-PCR
一、主要程序
1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复 合物；
2. 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合 物；
1.特异性强：
亲和素和生物素间的高亲和力。
2.灵敏度高：
每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。
3.快速、稳定： 4.应用广泛：
可与酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合；
二、 BAS的基本类型及原理
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、 间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。 ❖ BAB法： ❖ BA法： ❖ ABC法：
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6. BA-分离提纯技术
待分离物生物素化，结合于亲和素包被的固相载体上， 洗脱后，达到分离提纯的目的。
۞ Morag G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。
7. BA-时间分辨荧光免疫技术（BA-TRFIA）
➢应用BA-TR-FIA检测肿瘤细胞和血清中的肌酸转移
BB(CK-BB) , 发现CK-BB是乳腺癌的一个敏感指标,前列
腺癌病人血中的CK-BB也明显提高,因此认为该方法是
研究CK-BB与各种恶性肿瘤关系的敏感特异的方法。
➢该法中使用生物素化Ab和Eu3+(Eu3+是发光效率、
➢应用
临床诊断 生物医学 生物化学 环境监测
4. BA-免疫印迹技术
✓该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
✓免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。源自5. BA -组织化学技术
✓每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
✓双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测 相思子毒素
✓用亲和素-生物素ELISA检测GPV抗体 ✓生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定
双酚A
2. BA-分子生物学技术
将引物生物素化，经过PCR反应后,用(链霉)亲和素 固定扩增产物，进行下一步的显色或荧光等检测。
和素捕获
被捕获的目标序列再次进
行碱性磷酸酶标记的探针杂交反应
用化学发光微孔法检测
3. BA-电化学免疫技术
➢原理
将酶1标记的抗体结合在碳电极表 面组成传感器，与液体中待检抗原 和生物素化抗体及酶2标记的亲和 素免疫反应后，碳电极表面形成酶 1和酶2免疫通道，结果电信号被 放大。
优点 灵敏 快速 可定量
➢利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。
➢Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤 细胞结合后， 加入碱性磷酸酶-亲和素进行 染色检测， 证实了黑皮质素的结合受体位 于黑色素瘤细胞表面。
➢PereiraMM 等将ABC (生物素-亲和素-过 氧化物酶) 染色法用于钩端螺旋体的组织细 胞损害进行定位检查， 结果简单易测，此 法经常用于免疫组织化学检测中。
生物素－亲和素系统（BAS）用于检测的基本方法有三类：
I. 标记亲和素连接生物素化大分子反应体系， 称BA法，或标记亲和素－生物素法 （LBA）。
II. 以亲和素两端分别连接生物素化大分子反 应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥 联亲和素－生物素法（BRBA）。
III.将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素－ 生物素－过氧化物酶复合物，再与生物素 化的抗抗体接触时，将抗原－抗体反应体 系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法， 其中A－Ab为亲和素化抗体，B-Ab为生 物素化抗体。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
➢基本原理
生物素与抗体共价交联的方法简单，条件 温和，且一般不影响抗体的活性。生物素 与亲和素能快速结合，而且反应不受外界 干扰，具有高度特异性和稳定性，两者的 亲和常数比抗原－抗体反应高10－100万倍， 结合快，呈不可逆反应，而且在pH，温度、 有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能 稳定存在。
Thank you!
生物素（Biotin）－辅酶R、维生素H
是生物体内广泛分布的一种羧化酶 的辅酶，分子中有两个环状结构：
➢Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素
结合的主要部位。
➢Ⅱ环为噻唑环，上有一戊酸侧
链，其末端羧基是结合抗体和其他 生物大分子（如：酶、蛋白质、抗 体、DNA ）的唯一结构。
利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活 性生物素，以适合与各种生物大分子结合的需 要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N－ 羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基 酚酯(pBNP),其中以BNHS最为常用。近年来， 应用长臂生物素（BCNHS）标记生物大分子， 可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异 性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
涂敷稳定性、回收成本等最好的荧光粉 )标记的亲和
素,通过BA技术的多级放大作用,使得Ag-Ab复合物中
的螯合物Eu3+信号更强,提高了检测灵敏度。
8. BA-预定位技术
➢这项研究近年来发展迅速, 现已从动物实验阶段
进入临床应用研究。
➢Yao Z. 等利用植物血凝素能与肿瘤细胞表面的
糖蛋白和糖脂上的糖分子结合, 亲和素末端的N 乙酰葡萄糖胺和甘露糖残基能与植物血凝素结合 的特性, 用放射性同位素标记的生物素进行肿瘤定 位。
生物素化的 引物扩增目 的基因
微孔板内链霉 亲和素捕获 PCR扩增产物
用地高辛标记 的寡核苷酸探 针进行杂交
酶标抗体进 行显色反应
在分子生物学技术中较常用的技术还有：将核酸 探针结合上生物素，通过酶或其它示踪物标记的亲和 素进行显色等。
扩增rRNA的目标序列
与生物素化
探针进行杂交
通过微孔板内的链霉亲
1. BA-酶免疫技术
➢原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔 内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来， 能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
➢优点
✓生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。
✓生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。