第14章、蛋白质纯化策略
蛋白质纯化策略
Developing an efficient protein purification schemeDeveloping an efficient protein purification schemeIntroductionThree phase strategyCombining techniquesPurity requirementsCharacteristics of the target protein andcontaminantsExamplesSummary and shortcutsProtein Purification -Aims Sufficient purity and quantity Maintained biological activity Good economyYields from Multistep Protein PurificationsNumber of stepsYield (%)95% / step 90% / step 85% / step 80% / step 75% / step02040608010012345678Input for Purification Protocol DevelopmentThree phase strategyPurification protocolRequired purity and quantityPhysical-chemical properties of target and main contaminantsSource material informationSeparation techniqueknowledgeScouting runs and optimizationEconomy and resourcesProtein Purification Analytical tools•A rapid and reliable assay for the target protein•Purity determination(e.g. SDS-PAGE)•Total protein determination(e.g. colorimetric method)Three Phase StrategyPurityStepCaptureIntermediate purificationPolishingIsolate product,concentrate, stabilizeRemove bulk impuritiesAchieve final purity.Remove trace impurities, structural variants,aggregates etc.Capture ResolutionSpeedRecovery CapacityInitial purification of the target molecule from crude or clarified source materialConcentration and stabilization (e.g. removal of proteases)Intermediate PurificationResolutionSpeedRecovery CapacityRemoval of bulk impuritiesPolishing ResolutionSpeedRecovery CapacityFinal removal of trace contaminants, e.g. structural variants of the target proteinThree Phase Strategy -Ranking of Chromatography TechniquesTechnique Capture Intermediate Polishing GFIEXHICACRPC ConsiderationsLimited sample volume Limited flow rate range Protein ligand is sensitive to harsh cleaning conditions Use of organic solvents, loss of biological activityLinking Chromatography Techniques into a Purification Protocol -General RulesCombine techniques with complementary selectivities (e.g. IEX, HIC and GF).Minimize sample handling between purification steps (e.g. concentration, buffer exchange).Technique End conditions Start conditionsSmall sample volume GF Diluted sampleBuffer change (if required)Low ionic strength IEX High ionic strength orpH changeHigh ionic strength HIC Low ionic strength Specific binding conditions AC Specific elution conditions1. IEX HIC GF2. ACGFRPCIEX3. HICGFACGF 4. (NH 4)2SO 4HICIEXGFHICGFIEX5. GFGF(desalting)ACGFPurity RequirementsContaminants which degrade or inactivate the target protein (e.g.proteases), need to be reduced to “non-detectable”levels.Contaminants which interfere with subsequent analyses need to be reduced to “non-detectable”levels.It is better to “over-purify”than to “under-purify”.•Therapy•In vivo studies •Crystallization for x-raystudies•N-terminal sequencingof an unknown protein•Most physical-chemicalcharacterization methods•Antigen for monoclonalantibody productionExtremely high High Moderate Purity Requirements -Brief GuidelinesTowards the Optimal Purification Protocol -Towards the Optimal Purification Protocol -Accounting for Target Protein Properties (1)Target protein property Purification parameter affected Stability windowz pHz Ionic strengthz Co-factorsz Detergent concentration z Organic solventsz Other (light, oxygen etc.)IEX conditions (also AC and RPC)HIC conditionsselection of buffers, pH, salts, additives buffer additivesRPC conditionsvariousTowards the Optimal Purification Protocol -Towards the Optimal Purification Protocol -Accounting for Target Protein Properties (2)Physical-chemical properties •Charge properties (isoelectric point)•Molecular weight •Post-translational modifications•Biospecific affinityTarget protein property Purification parameter affectedselection of IEX conditions selection of GF mediumselection of group specific AC medium selection of ligand for ACTarget Protein Stability Window Determination of a suitable ammonium sulfateconcentration and pH screening range for HICTarget Protein PropertiesSelection of ion exchange conditions5 6 7 8pHm o l e c u l e s c h a r g e+-Electrophoretic titration curve of chicken breast muscleusing zymogram detection for creatine kinaseTarget proteinContaminantsG Protein Receptor Kinase PurificationTechniquePptHICAIEXCIEXACPurificationfactorComment720240818647•All buffers containprotease inhibitors•All purifications done at +4o C•Removal step, maincontaminant is bound•Elution buffer is used asstarting buffer for next column•10 µg homogenous proteinobtainedA. Tobin et al. (1996)J. Biol. Chem. 271, 3907-3916 Porcine cerebellahomogenateRESOURCE QAmmonium sulfateprecipitationButyl SepharoseFast FlowRESOURCE sHiTrap HeparinRec α-Mannosidase Purification from PichiaTechniquePurification factorComment•83 µg homogenous protein obtainedY.-F. Liao et al. (1996)J. Biol. Chem. 271, 28348-28358•Capture with step gradient;730 mg of total protein applied63622719UFGF AIEX HIC Phenyl Sepharose HPQ Sepharose FFSuperdex 200 pgUltrafiltrationDNA Binding Protein PurificationTechniqueDNA-1 Sepharose CIEXAC AC AC CIEXPurification factorComment584943•General AC step for DNA binding proteins•Removal step, non-specific DNA binding activity removed •Main purification step •Final polishing, 20 µg protein obtainedJ. Berthelsen et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 3822-383092447•Rapid captureHeLa cell nuclearextracts SP Sepharose HighPerformance Heparin SepharoseFast Flow DNA-2 SepharoseMono S•Final polishing and purity check , 20 µg obtainedMembrane Protein PurificationTechniqueAC AIEX CIEX AC CIEXPurification factorComment341442•Negative step; contaminant removed•Detergent exchange, volume reduction before AC •Main purification stepT. White et al. (1995)J. Biol. Chem. 270, 24156-241656242•Step gradient, rapid concentrating capture stepPlacenta extract in 1.5% Triton X-100Blue Sepharose DEAE Sephacel SP Sepharose FF Muc2 SepharoseMono STowards a General Protein PurificationProtocolA rapid method for obtaining milligram quantities of different recombinant proteins, for initial characterization studiesSemi-automated in ÄKTAexplorer, with pre-made method templates and BufferPrepIon exchangeSTREAMLINE SP or DEAEHydrophobic interactionSP or Q Sepharose FFPhenyl Sepharose FF (high sub)Gel filtrationSuperdex75 prep gradeTowards a General Protein PurificationProtocol -Results with E. coli r-Proteins Ion exchangeSTREAMLINE SP or DEAEHydrophobic interactionSP or Q Sepharose FFPhenyl Sepharose FF (high sub)Gel filtrationSuperdex75 prep gradeProtein Expression Capture step(purified to homogeneity)Annexin V Extracellular STREAMLINE DEAEα-Amylase Intracellular STREAMLINE DEAEanti-gp120 Fab Periplasmic SP Sepharose Fast FlowShortcuts -Rapid Establishment of Milligram Scale Purification ProtocolsIf a biospecific ligand is available:use AC as the main purification step.If the purification is not intended to be scaled up:use high performance media (e.g. MonoBeads) throughout.For “one-of-a-kind” purification of a protein e.g. for sequencing before gene isolation:sacrifice yield for purity by making narrow cuts.If nothing is known about target protein and contaminants properties:try the IEX HIC GF combination.Establish a fast and reliable assay for the target protein.A Systematic Approach to PurificationDevelopment -SummaryDevelop assay methodsSet the aims (purity and quantity)Characterize the target proteinUse different separation principlesUse few stepsLimit sample handling between purification stepsStart with high selectivity -increase efficiencyRemove proteases quicklyReduce volume in early stepKeep it simple!。
蛋白质分离纯化技术
♣单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的 筛孔的大小不同。
♣分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗 脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大 分子物质迁移速度快；
♣小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶过滤层析过程示意图
优点
1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定， 所以凝胶本身不与样品发生化学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和，不易引起生物物质 的变性，即使用来分离一些理化性质不稳定的物 质也很少被破坏。 3.样品得率高，重复性好。如果按比例扩大柱的体 积和高度，可进行大量样品的分离纯化。
分离大蛋白质 小蛋白质 除盐 2、琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国BioGelA）
孔径大，用于分离大分子物质 3、聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）
结 构 ： 葡 聚 糖 用 交 联 剂 1- 氯 -2,3- 环 丙 烷 使 葡 聚 糖 之 间 通 过 醚 键 (C-O-CH2CH-CH2-O-)交联聚合而成的
中
等电点沉淀和pH控制
不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的 原理，可以把蛋白质混合物分开。这样沉淀出的蛋白质保持着天然构 象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
有机溶剂分级分离
丙酮、甲醇、乙醇等沉淀: 能使蛋白质在水溶
液中的溶解度将低。低温（零下40-60度）进行，丙酮用量一般10倍于蛋 白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。
缺点
1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限，所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，如芳香族化合物与脂蛋白等。
蛋白质纯化
蛋白质纯化词条已锁定摘要目录1蛋白质纯化2内容提要2.1亲和纯化样品的前…2.2亲和纯化步骤目录1蛋白质纯化2内容提要2.1亲和纯化样品的前…2.2亲和纯化步骤收起蛋白质纯化蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。
一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。
为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。
通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。
其蛋白质分离纯化主要方法包括：（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析)（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；（4）蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）（5）根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）内容提要一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积-起始目的蛋白量2. 细菌裂解获得可溶蛋白· BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法·机械破碎（如超声等）Ni-NTA 树脂纯化二、亲和纯化步骤1. Ni-NTA树脂的兼容性2. 天然条件纯化·柱层析· FPLC·批次小量纯化3. 变性条件的纯化·柱层析· FPLC 纯化·批次小量纯化4. 树脂再生5. 常见问题与改善建议一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积-起始目的蛋白量纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。
【精品】生化第十四章
第十四章蛋白质生物合成一、填空题1．蛋白质的生物合成是以____作为模版，_____作为运输氨基酸的工具，____作为合成的场所。
2．细胞内多肽链合成的方向是从端到端，而阅读mRNA的方向是从_____到___端。
3．核糖体上能够结合tRNA的部位有部位、部位和部位。
4．ORF是指，已知发现最小的PRF只编码个氨基酸。
5．蛋白质的生物合成通常以作为起始密码子，有时也以作为起始密码子，是以和以及作为终止密码子.6．SD序列是指原核细胞mRNA的5′端富含碱基的序列，它可以和16SrRNA的3′端的序列互补配对，而帮助起始密码子的识别.7．含硒半胱氨酸的密码子是。
8．原核生物蛋白质合成的起始因子（IF)有种，延伸因子(EF）有种，终止释放因子(RF）有种；而真核生物细胞质蛋白质合成的延伸因子通常有种，真菌有种，终止释放因子有种。
9．密码子的第二个核苷酸如果是嘧啶核苷酸，那么该密码子所决定氨基酸通常是。
10．原核生物蛋白质合成中第一个被掺入的氨基酸是。
11．真核生物细胞质蛋白质合成对起始密码子的识别主要是通过机制进行。
12．无细胞翻译系统翻译出来的多肽链通常比在完整的细胞中翻译的产物要长,这是因为。
13．蛋白质的半寿期通常与端的氨基酸性质有关。
14．tmRNA是指。
15．同工受体tRNA是指。
16．疯牛病的致病因子是一种.17．已发现体内大多数蛋白质正确的构象的形成需要的帮助，某些蛋白质的折叠还需要的催化酶是和。
18．SRP是指，它是一种由和组成的超分子体系，它的功能是。
19．蛋白质定位于溶酶体的信号是。
20．分子伴侣通常具有酶的活性。
21．某些蛋白质基因的编码链上并无终止密码子，但可以通过Pre—mRNA的和两种后加工方式引入终止密码子。
22．蛋白质内含子通常具有_____酶的活性。
23．已有充分的证据表明大肠杆菌的转肽酶由其核糖体的____承担。
24．决定蛋白质进入过氧化物酶体的信号肽是____。
蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
蛋白质纯化策略并举例
蛋白质纯化策略并举例蛋白质纯化是研究蛋白质特性和功能的重要步骤之一、纯化蛋白质的目的是将目标蛋白从混合物中分离出来，并去除其他干扰物质，以便进一步研究和利用。
蛋白质纯化的策略可以根据蛋白质的性质和混合物的组成选择不同的方法。
下面将介绍几种常用的蛋白质纯化策略。
1.借助溶液性进行纯化一种常见的方法是根据蛋白质在不同溶液条件下的溶解性来纯化蛋白质。
例如，如果目标蛋白质在酸性条件下溶解，在中性或碱性条件下不溶解，可以通过调整溶液的pH值来实现纯化。
另一个例子是，一些蛋白质在高盐浓度条件下溶解，在低盐浓度条件下沉淀，可以通过逐渐降低盐浓度来实现纯化。
2.借助分子大小进行纯化一些蛋白质具有与其他成分相比较明显的不同分子大小。
利用这种特性，可以选择适当的分离方式进行纯化。
一种常用的方法是通过凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）纯化蛋白质。
该方法利用分子大小的差异，使大分子物质通过凝胶较快，小分子物质则需要在凝胶中较长时间停留，从而实现纯化目标蛋白质。
3.借助电荷进行纯化一些蛋白质具有特定的电荷性质，可以根据其在不同条件下的电荷状态选择适当的分离方式。
例如，离子交换层析（ion exchange chromatography）可以通过调整缓冲液的 pH 值，利用蛋白质与离子交换树脂之间的相互作用，实现目标蛋白质的纯化。
还有一种常见的技术是等电聚焦（isoelectric focusing），该方法是利用蛋白质在不同 pH 值下的等电点移动来实现纯化。
4.借助亲和性进行纯化5.借助活性进行纯化一些蛋白质具有特定的酶活性、配体结合性等活性，可以通过专一酶活性或配体结合性来进行纯化。
例如，利用蛋白质的酶活性，可以通过亲和层析和酶反应来实现目标蛋白质的纯化。
还可以根据蛋白质与配体结合的特异性，利用亲和层析等方法实现纯化。
以上是常见的几种蛋白质纯化策略及其举例。
需要注意的是，每种策略都有其适用范围和局限性，因此在纯化蛋白质时需要根据具体情况选择合适的策略，并结合多种方法进行组合使用，以达到最佳的纯化效果。
试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法
试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白质分离纯化课件
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• 被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的， 构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
• 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质 作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制 剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体 共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose－4B 等。
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质
比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不 能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。
b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术
可逆沉淀： 等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀
不可逆沉淀： 热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀
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1、根据溶解度不同
（1）盐析（salting out） 1）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象 称为盐溶（salting in），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐 下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（salting out）。 2）原理 Salting in：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互 作用加强→溶解度提高。 Salting out：大量中性盐加入→破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的 活度，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互聚集而析出。 3）盐析中最常用的盐是： (NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。 原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天 然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。
蛋白质分离纯化的方法doc
分离纯化蛋白质的四种关键性方法分离蛋白质的方法有许多种,应根据原材料和生产条件来选择具体的分离纯化方法。
例如:李凤英等[5]用盐溶法提取葡萄籽的蛋白质。
李喜红等[6]用酶法从脱脂米糠中提取蛋白质。
郭荣荣等[7]碱法与酶法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究得出结论是碱法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性优于酶法提取的大米蛋白,而酶法提取的大米蛋白的溶解性、乳化稳定性和泡沫稳定性优于碱法提取的大米蛋白。
王桃云等[8]就是运用这种方法配合使用加热法提取葎草叶蛋白。
陈申如等[9]用酸法提取了鲢鱼鱼肉蛋白质,提取的蛋白质无腥味,色泽洁白,蛋白质产率高,可达90%左右。
以下介绍四种分离纯化蛋白质的方法。
1区带离心法区带离心法是分离蛋白质的有效而且常用的方法。
该法的第一步是在离心管中形成一个密度梯度(常用蔗糖梯度),然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。
超速离心时,蛋白质即通过密度梯度移动,并根据其沉降系数而被分开,最后各种蛋自质在离心管内被分离成各户独立的区带,可以在管底刺一小孔逐滴放出,分部收集。
2 层析法最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。
2.1 凝胶过滤(GFC)[10-12]凝胶过滤也叫凝胶色谱和分子筛层析,是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。
凝胶过滤是一种快速而简便的分离分析技术,可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。
柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物,最常用的是葡聚糖凝胶〔其他有聚丙烯酞胺凝胶和琼脂糖凝胶等)。
仙聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物,不同型号的葡聚糖凝胶其“网眼”大小不同,可以用来分离纯化不同分子大小的物质。
当蛋白质混合物通过层析柱时,比“网眼”大的蛋自质分子不能进入凝胶颗粒内部,不能沿着颗粒间隙流动,流程短,流速快,最先流出柱外;比“网眼”小的分子则进入凝胶颗粒内部,沿着孔道移动,从一个颗粒流出,又进入另一颗粒,所以下移速度慢,随后被洗脱下来。
蛋白质表达及纯化策略
蛋白表达及纯化策略一.目录：含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化GST-融合蛋白的纯白化策略DEAE纯化蛋白策略分子筛纯化蛋白策略二.试剂：所用试剂均购自上海生工三.资料来源：汪德强老师四.撰写：罗淼牛司强含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。
将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。
通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。
生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。
生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。
低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。
IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。
所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
蛋白质纯化技术[仅供参考]
![蛋白质纯化技术[仅供参考]](https://img.taocdn.com/s3/m/a20dd76b10a6f524cdbf855e.png)
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蛋白质工程中进行蛋白质纯化医疗类的别 必要性
• 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料， 研究其结构与功能；
• 其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单 一的蛋白质作为原材料；
• 最后，为了生产性能更优良的蛋白质， 需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯 化，从而开发出相关产品。
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医疗类别
4.1.1 分子筛层析 （Gel filtration）
• 原理
▫ 也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材 料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时， 分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同 而先后流出，从而达到分离纯化的目的。
• 凝胶介质
▫ 葡聚糖 （glucose） ▫ 琼脂糖 （agarose） ▫ 聚丙烯酰胺（acrylamide） ▫ 纤维素（cellulose）
22
1.5配体特异性结合
医疗类别
• 原理
▫ 生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识 别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结 合能力称为亲和力。
• 方法
▫ 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶 性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆 性对另一个分子进行分离纯化。
• 分类
▫ 免疫亲和层析 ▫ 生物亲和层析 ▫ 金属螯合亲和层析
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•亲和层析（Affinity chromatogra医疗p类别hy）
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•His-亲合示意图（金属螯医合疗类别 层析）
镍柱（Ni-NTA）
固相载体
PET expression system
54
医疗类别
4.1.4 疏水作用层析
• 原理
▫ 蛋白质表面疏水基团与介质疏 水配体的可逆相互作用
蛋白分离纯化操作及策略
蛋白质纯化一般步骤
1. 样品准备
2. 捕获
3. 中间纯化 4. 精纯
蛋白质纯化策略
层析的目标
• 目标
– – – – 纯度，Purity (>90% vs. ≥ 99.9%) 活性，Activity (active vs. inactive) 含量，Quantity (ng or mg levels) 关键杂质的对数减少，Log reductions of key contaminants
2
Recovery table of purification steps
纯化步骤 总蛋白浓度 纯度 回收率
2
酵母发酵上清液
中空纤维柱超滤
0.1mg/ml
0.5mg/ml
8.5%
14%
100%
60%
羟基磷灰石层析 CHT
阴离子交换层析High Q P-6 DG柱脱盐 总回收率
0.3mg/ml
0.4mg/ml 0.3mg/ml
• 选择层析类型
– 技术类型 – 变性/非变性，Denaturing/non-denaturing – 分辨率，Resolution – 得率，Yield – 速度，Speed
得率 时间
活性
工艺策略
各步骤的评价参数
纯度 得率 生物活性 工艺时间
各步骤的评价方法
电泳：SDS-PAGE，PAGE 蛋白质浓度测定 生物活性测定
Before Starting…
纯度
• 必须了解的蛋白特性
– 分子量与等电点 – pH、温度稳定性，pH, temp stability – 盐、去污剂、有机溶剂和金属离子的影响 Effects of salt, detergents, organic solvents, metal ions – 翻译后修饰，Post-translational modifications
课程考试
1.已知某蛋白质由两条肽链组成，如何用 SDS-PAGE判断它们之间是以共价键连接的?
若二者以共价键（二硫键）方式相连 接，经还原SDS-PAGE后，可显示两条谱带， 通过迁移率与标准分子质量曲线就可求出 两个亚基的分子质量。
饱和度与浓度概念不同，前者加入溶质前后体积不一样，
后者加入溶质前后体积一样，故计算方法不同。 硫酸铵密度为1.77 g/ml。 1000 ml 水+767 g硫酸铵后总体积为1433，此时硫酸铵浓 度为0.54 g/ml； 1000 ml 水+313 g硫酸铵后总体积为1176，此时硫酸铵浓 度为0.27 g/ml； 1000 ml 水+383.5 g硫酸铵后总体积为1217，此时硫酸铵 浓度为0.32 g/ml；
第13章、生物活性测定技术
记住第14章中“蛋白质功能研究”部分内容 即可。
第14章、蛋白质纯化策略
本章基本所有内容均需掌握
其他
1、蛋白质脱盐可用哪些方法？其原理是什 么？ 2、蛋白质浓缩可用哪些方法？其原理是什 么？ 3、设计与评价蛋白的纯化方案。
思考题集
3、密度梯度离心的基本原理与实 验操作。
第3章Biblioteka 沉淀法1、 盐溶、盐析的定义及原理；硫酸铵沉淀的优缺 点；硫酸铵沉淀（包括分级沉淀）的操作及注意事 项；如何使用“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”； 盐析曲线的制作与盐析范围的确定；硫酸铵沉淀的 影响因素。 2、有机溶剂沉淀的原理、操作、注意事项、影响因 素及优缺点。 3、等电点沉淀的原理，为什么等电点沉淀一般不单 独使用？
3、某纯酶和粗酶的盐析分级范围 是否相同?为什么?
纯酶和粗酶的盐析分级范围是不相同的， 因为粗酶中有比较多的杂蛋白，在盐析时将 会产生共沉淀现象，尤其是酶溶液浓度比较 高时共沉淀现象将更为严重，致使盐析分级 范围发生变化。
蛋白的分离纯化详解(分析“蛋白质”文档)共63张PPT
学反应。 蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。
最常用的蛋白定量方法是凯氏定氮法， Lowry Folin法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等。 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。 生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。 而可用于ELISA的抗体则有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。 配体特异性结合 重点 为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该 过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。
Ve，即可从图中得到样品的分子量。
SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的
• 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话） 的分子量；
• SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量； • 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得
蛋白质每条多肽链的分子量。 • 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信
平衡离子：H+, Na+, Cl-, OH-
基本液中） 3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰
4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
• 分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分 次洗脱样品蛋白的方法；
• 梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。
变性和复性
• 原理：蛋白质在一定的理化条件下失去原 有的空间结构、生物学功能及部分理化特 性等称为变性。当变性条件去除后恢复原 有的空间结构及生物学功能即为复性。
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯化 原核表达蛋白
蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化方法及问题解答蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。
蛋白质纯化策略并举例
2. Minimize sample handling between purification steps
纯化步骤间样品处理降到最低 – e.g. concentration, buffer exchange 如样品浓缩，缓冲液更换
分子量 的对数
相对疏 水性
Elute
Elution buffer: Binding buffer with increased amount of imidazole
Native conditions
Binding buffer Fusion protein Cell protein
Binding buffer
Pure fusion protein
色谱：吸附目标蛋白，去除大部分杂质
精细纯化1 精细纯化2 浓缩 过滤消毒
Chromatography: Adsorption of contaminants.
色谱：吸附杂质
Chromatography: Final step to remove contaminants very similar to the desired protein
Some applications demand high purity
需要高纯度的应用
Structural studies
结构研究
Biopharmaceutical production
生物制药
Authority regulated e.g. FDA
权威部门许可, 如 FDA 检查不纯物： • DNA 核酸
总的表面电荷数
分辨率 Rs
- 分子和选择性有关 - 选择性和分离化学有关 - 分母和柱效有关 - 柱效和填料颗粒大小有关
蛋白质纯化方案
蛋白质纯化方案一、引言随着生物技术的发展，蛋白质纯化在生物医药领域扮演着重要的角色。
蛋白质纯化方案的设计和优化对于获得高纯度的蛋白质样品至关重要。
本文将介绍一种有效的蛋白质纯化方案。
二、背景在进行蛋白质纯化之前，我们需要了解目标蛋白质的特性。
这些特性包括分子量、溶解度、等电点等，以帮助我们选择适合的纯化方法。
三、材料和方法1. 细胞培养和裂解将表达目标蛋白质的细胞进行培养，然后使用合适的裂解方法将细胞壁破裂释放出蛋白质。
2. 前处理步骤a. 清除杂质：利用低速离心和滤过等方法将细胞碎片、核酸和其他杂质去除。
b. 浓缩样品：通过超滤或溶剂沉淀来浓缩目标蛋白质。
3. 色谱柱层析a. 亲和层析：使用具有亲和性层析介质的柱子，根据目标蛋白质与其配体之间的相互作用来纯化蛋白质。
b. 尺寸排阻层析：根据目标蛋白质的分子量，选择合适的层析介质，利用分子量的差异将杂质分离。
c. 离子交换层析：根据目标蛋白质的等电点选择适当的离子交换介质，通过离子交换作用实现蛋白质分离。
4. 后处理步骤a. 再生和洗脱：根据柱层析的原理和介质的特性，选择合适的缓冲液洗脱目标蛋白质。
b. 纯化评估：利用SDS-PAGE、质谱等技术评估纯化效果。
五、结果和讨论通过本文所描述的蛋白质纯化方案，我们成功地获得了高纯度的目标蛋白质。
其中，亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析相结合的层析流程有效地去除了杂质，并且保留了目标蛋白质的活性。
六、结论本文所介绍的蛋白质纯化方案通过合理的层析和后处理步骤，能够高效地纯化目标蛋白质，并保持其活性。
该方案的优点在于其广泛的适用性和高度的可调性，可以根据目标蛋白质的特性进行相应的调整和优化。
七、致谢在此，感谢所有参与本研究的人员的辛勤工作和支持。
参考文献：[1] Smith A, Johnson B. Protein purification: Principles and practice[M]. Springer Science & Business Media, 2011.[2] Scopes R. Protein purification: principles and practice[M]. Springer Science & Business Media, 2002.。
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分离机理： 带电性质差异
考虑到DACOS蛋白的酸性 pI 和稳定性, 缓冲
液选择中性 pH
粗纯
阴离子交换层析柱: HiPrep™ 16/10 Q XL
线性梯度
mAU mS/cm mAU 400 80 3000
阶段梯度
mS/cm 80 3000
优化梯度
mAU mS/cm 80
300 60 2000 200 40 1000 20 20 40 1000 40 60 2000 60
储存。
目标：得到所需的
载量
高纯度产物。
每一步骤采用不同 的纯化技术。
所选取的技术，必须能够区分目标蛋白质
和其它剩余的污染物。
通常需要选择一种高效率、体积小、大小
均匀的球状介质。
用在纯化过程中的蛋白的特性
蛋白特性 电荷 大小 疏水性 生物识别 （特异性配基） 对有机溶剂的稳定性
技术 离子交换(IEX) 凝胶过滤(GF) 疏水性相互作用 (HIC) ， 反相作用(RPC) 亲和性(AC) 选择反相色谱
明确需要纯化的目标蛋白质的特性和关键的杂质。
发展检测分析技术。
使每一阶段处理的样品最小化。
尽可能少地使用添加剂。
尽早去除对样品有损伤的杂质。 在每一步纯化过程中使用不同的纯化技术。 使用的纯化步骤尽可能少。
3
14.2、样品准备
1、纯度要求
用途 用于治疗，体内试验 纯度 非常高> 99%
选择精细纯化层析技术
分子筛 SEC:
- 简单 - 有力的补充IEX和HIC
分离机理: 分子量差异 最适合分离二聚体, 寡聚体和聚合物
DAOCS - 优化后的粗纯步骤
层析柱: HiPrep™ 16/10 Q XL
阴离子交换 • 浓缩样品 • 快速去除大量杂质
mAU 3000
mS/cm
80
40分钟 120分钟 80分钟
精细纯化
层析技术的衔接
粗纯
中间纯化
精纯
最常用的 步骤组合
通过离子交换层析进行样品捕获
一 个 标 准 的 纯 化 步 骤
碱性蛋白：阳离子交换层析 建议使用的结合缓冲液：20 mM 磷酸钠, pH 7 建议使用的洗脱缓冲液： 结合缓冲液 + 0.5 M NaCl 酸性蛋白质：阴离子交换层析 建议使用的结合缓冲液: 50 mM Tris.HCl, pH 8 建议使用的洗脱缓冲液: 结合缓冲液 + 0.5 M NaCl
X(射)线衍射晶体分析法和多数物 高 95- 99 % 理、化学特性鉴定方法 用于抗原来制备抗体、 N 端测序 适中 < 95 % 分析
4
2、蛋白质特性和相应的纯化策略
样品和靶蛋白质特性 纯化策略 对温度的稳定性 需要在更低的温度下快速操作 pH稳定性 提取或者纯化缓冲液的选择。离子 交换条件的选择，亲和或者反相色谱 的选择。 去污剂需要量 考虑色谱步骤的影响和去除去污剂 的需要。考虑去污剂的选择。 耐受盐（离子强度） 针对沉淀技术、离子交换技术和疏 浓度 水性相互作用色谱，选择需要的条件。 辅助因子对于蛋白稳 添加剂、pH值、盐和缓冲液的选择 定性 对蛋白酶的敏感性 需要快速去除蛋白酶或者加入蛋白 酶抑制剂 对金属离子的敏感性 需要在缓冲液中加入EDTA或者EGTA 对氧的敏感性 需要加入还原剂
DAOCS - 纯化策略
中度纯化 粗纯 精细纯化
准备样品 DAOCS· 性质 纯化目标
DAOCS - 纯化目标
目标：
得到 5-10 mg DAOCS，纯度足够进行结晶和
X-晶体衍射分析 一个工作日内完成整个纯化流程
DAOCS – 目标蛋白的性质
参数 等电点 分子量 数值 4.8 34 500 对纯化设计的影响 在粗纯时使用离子交换层 析 用 Superdex™ 75 prep 凝 胶过滤技术进行精纯 (370kD)
常用的蛋白沉淀方法：硫酸铵沉淀（非变
性） 、聚乙二醇沉淀（非变性）和有机溶剂 沉淀（可能变性）。等电点沉淀法通常配合 其他沉淀法联合使用。
13
14.3、三步纯化策略
纯化技术的选择和组合
每一种技术都在分辨率、 容量(载量)、速度和回 收率之间达到一种平衡。 • 样品处理最小化 • 纯化步骤最少化 • 在每一步骤中使用 不同的技术
反相色谱
★
★★★
综合考虑起始和结束条件进行衔接
纯化技术 结合条件 洗脱条件 浓度
离子交换 疏水性 相互作用
亲和色谱
低盐 高盐
特定条件
高盐 低盐
特定条件 常液洗脱
增加 增加
增加 降低
凝胶过滤 不结合 Superdex™
设计合理的纯化路线
粗纯
中间纯化
精纯
使用不同层析技术 选择性互补 尽量避免样品处理步骤
超滤
在进行第一步色谱分离前使用。去除盐类和
浓缩样品。
在一个实验运行过程中检查目标蛋白的回收
率。一些蛋白会非特异性吸附到膜表面。
12
分段沉淀
在实验室规模下提取和澄清样品。用于部分
纯化样品，具有浓缩样品的效果。在进行第 一步色谱步骤之前使用。 大多沉淀技术不适合大规模的准备工作。
异性吸附的物质：10000g离心15分钟；对于 细胞匀浆，离心40000~50000 g 30分钟。
过滤
在第一次色谱分离前使用。去除颗粒物质。
适用于小样品体积，按照色谱介质中分离颗 粒的大小选择过滤器。
色谱介质中颗粒的大小 90 μm 和更大的珠子 3, 10, 15, 34 μm 除菌过滤或者额外净化样品 过滤器大小 1 μm 0.45 μm 0.22 μm
各种纯化技术的主要特点
纯化技术 离子交换 疏水性 相互作用 分辨率 ★★★ ★★★ 处理量 ★★★ ★★★ 处理速度 ★★★ ★★★
亲和色谱
凝胶过滤 Superdex™ 反相色谱
★★★
★★★ ★★★
★★★
★ ★★★
★★
★ ★★
各种纯化技术在不同纯化阶段的使用
纯化技术 离子交换 疏水性 相互作用 亲和色谱 凝胶过滤 Superdex™ 捕获 ★★ ★ ★★ ★★ ★ 中度纯化 精细纯化 ★★★ ★★★ ★★★ ★★★ ★ ★ ★★ ★★★
样品条件的改变
一个用于在两步纯化之间通过缓冲液交 换进行快速脱盐和调节pH值的理想介质是
Sephadex G-25
加载的样品体积可以高达总柱体积的30%， 或者在一些情况下达到总柱体积的40%。
案例分析：重组酶的三步纯化
靶分子：脱乙酰氧基噻孢霉素C聚合酶
（ DAOCS ） ，氧敏感酶。
源材料：以可溶性形式在大肠杆菌的细胞
200
DAOCS -优化后的精细纯化步骤
层析柱: HiLoad™ 16/60 Superdex™ 75 prep grade
分子筛层析 • 去除聚合物和其余 少量杂质污染物 • 置换缓冲液
mAU
1000
800
600
400
200
0 0 20 40 60 80 100 ml
DAOCS 纯化 - 结果
物的进一步去除 速度 收率
在每一步中使用不同的技术，使 纯化步骤数最少
目标：样品的纯
化和浓缩
载量
所使用的技术必须具有较高的分辨率。一
般需要连续梯度洗脱。
使用一个补充的具有选择性的技术，用于
样品的捕获阶段。
Polishing 精纯
定义：最终去除微 分辨率
量的污染物；调整PH值、
盐及添加剂浓度以便于 速度 收率
Capture 捕获（粗纯）
定义：在原始溶液 分辨率
或者被澄清的原液中，
对目标靶分子进行初步 速度 收率
尽可能早的去除有害的杂质
纯化。
目标：快速分离、
载量
稳定和浓缩目标物。
使用高容量的浓缩技术减少样品体积，使
样品能够更快速的纯化和能够应用更小体 积的柱子进行样品纯化。
在第一步纯化中应该使用稳定的和简单的
盐稳定性
>2 M 可以使用疏水层析 (NH4)2SO4 一般稳定性 容易氧化 在缓冲液中加 DTT
DAOCS – 注意事项
在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸残基保
持还原状态，防止氧化
加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白酶解
用 SDS-PAGE 检查每一个组份中 DAOCS 终产品通过酶活测定来确认生物活性
精细纯化 中度纯化
mAu 400
mAU 1000 800 600 400 200 0
粗提
mAU 3000
300 200 100 0 0 100 200 ml
02040 Nhomakorabea60
80
100
ml
mS/cm
80
2000 1000 60 40 20 0 0 100 200 ml 0
DAOCS 纯化 - 总结
工艺 优化
纯化技术。当处理原始样品时，不要试图 在一个纯化步骤中解决所有问题。
在捕获阶段，分辨率并不是主要考虑的因 素，所以可以增大上样量（高上样量可以降 低分辨率）。 高的速度、高的容积和低的缓冲液消耗对 于大规模的纯化特别有利。
Intermediate purification 中度纯化
分辨率 定义：大量污染
载量，在一些情况下，加载样品的总量或许会受到上 样体积的限制（如在凝胶过滤色谱中）或者受到大量存 在于样品中的污染物的限制，而不是靶蛋白的总量的限 制。 速度，在开始纯化阶段速度是一个最重要的环节，需要 尽可能快的将样品中的污染物如蛋白酶等必须去除的物 质除去。 回收率，在整个纯化的进程中，回收率的重要性会逐渐 增加，因为被纯化产品的价值在逐渐增加。回收率受到 对样品破坏过程的影响和不适宜色谱柱条件的影响。 分辨率 高分辨率的获得是通过对色谱技术的选择和色 谱介质的效率来形成一个很窄的色谱峰。