碱性磷酸酶的活力测定(修改版)
碱性磷酸酶活性测定
碱性磷酸酶活性测定磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
碱性磷酸酶活性测定
方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠+H2O
苯酚+磷酸氢二钠
= （A —A ） X 0.05 X 100（kings单位） ALP 活力 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热测定
对照
来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。
（A —A ） 掌握酶活力测定的一般方法
标准
空白
碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠
pH=10
苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化红钾色醌亚胺衍生物
保持反应时温度是均衡的保持反应时温度是均衡的3737c测定管测定管标准管标准管空白管空白管对照管对照管血清血清mlml01000100酚标准液酚标准液01000100蒸馏水蒸馏水01000100ph10ph10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液100100100100100100100100混匀3737水浴保温水浴保温5min5min同时将底物预热同时将底物预热底物液底物液100100100100100100100100混匀3737水浴保护水浴保护15min15min铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液300300300300300300300300血清血清01000100计算公式计算公式
2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水 煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防 腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）
血清碱性磷酸酶活性测定
器材：
5ml移液管、1ml移液管、加样枪、分光光度计、1cm比色皿 37°C水浴锅
实验操作
取4支试管，如下操作：
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色， 以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 *保持反应时温度是均衡的，37°C
计算公式
ALP活性金氏单位定义: 每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚
• 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、 胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较 多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生 成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、 蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为 去磷酸化或脱磷酸化。
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是 酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
反应速度↑ 活力↑
酶活力测定方法
• 终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶 促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平 均速度。
硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测 定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中 ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。
实验小结
磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精 密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际 单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基 酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。
碱性磷酸酶的活力测定(修改版)
3.1 3.05 3.0 2.9 2.8 2.7
4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血 1
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2
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血清应分别作对照管
5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久 置
计算
• ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金 氏单位）
【注意事项】
1、 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的 作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。
2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色， 说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。
3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终 单击编辑标题 单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体， 止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。 更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。
细胞内酶
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• 它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种 方法又可分为：
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实 验方法）。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对 硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。
• 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测 定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
实验碱性磷酸酶比活力测定
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min）
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 （min）
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中，但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。
实验 碱性磷酸酶比活力测定
实验目的
掌握酶活性测定方法的一般原理方法
测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力
实验原理
酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反应的
能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学 反应速度表示。 酶催化的反应速度越快，酶活性越高，反之则愈低。 底物减少量或生成物增加量
6
0.6 0.2
8碱性磷酸酶比活力测定
（3）消得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
血清碱性磷酸酶活力测定
酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶 活力单位数，即酶活力浓度。
酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法）
实验目的
熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义
（一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴
（二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠
6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃ 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L， 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级 标准品。
1．血清ALP活性升高可能原因如下 ：①肝胆疾病：阻塞性黄 疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于 骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血 液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、 佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。
2．血清ALP活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢 性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。
实验操作
1.取试管4支，按下表操作
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定项目名称碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定xinpingzhao@实验目的1. 了解酶提取纯化的基本实验技术;2. 掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法实验材料新鲜兔肝或兔肾主要仪器设备匀浆器,冷冻离心机,分光光度计,电子天平等.实验原理碱性磷酸酶（简称AKP）在磷酸盐代谢中起重要作用。
核酸序列分析、DNA重组技术、酶标免疫检测技术以及临床检验中都需要利用此酶。
本实验取材于兔肝，经匀浆、正丁醇抽提、硫酸胺分段盐析或者有机溶剂沉淀，获得碱性磷酸酶制品。
本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活。
对硝基苯磷酸二钠在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，对硝基苯酚在强碱性条件下显示亮黄色，在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以测定405nm处的吸收值A405nm来计算产物的生成量，从而计算出酶活力，然后通过各级纯化步骤产物蛋白含量的测定,从而计算出酶的比活力.第一部分: 碱性磷酸酶的提取以下操作均在4℃进行。
方案一:1. 称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，按1:2（m/v）加入预冷的0.05mol/LTris-HCl （pH9.0）缓冲液，匀浆后4℃抽提20 min；4℃，8000r/min离心10min；取上清；此为A 液。
另取1支试管编号为A，取0.1mLA 液，加1.9mLTris缓冲液(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.上清液中加入1/5体积预冷正丁醇脱脂20min；8000r/min离心10min，取上清；此为B液。
吸取0.1m1B 液，置于编号为B 的试管中，加入1.9m1Tris 缓冲液(pH 8.8)，供测酶活用。
3.加入硫酸铵至35%饱和度；4℃30 min；8000r/min离心10min，弃沉淀；取上清；此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用4.然后在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度，4℃静置30 min后8000r/min离心10min，得沉淀..用0.05mol/LTris-HCl（pH9.0）缓冲液溶解沉淀；此为D 液。
血清中碱性磷酸酶活力的测定
妇女。 妇女。 见于生长中的儿童及妊娠中晚期
2）病理性增加：主要见于（1）肝胆疾病。阻塞性 病理性增加：主要见于（ 肝胆疾病。
黄疸，急、慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活 ALP活 黄疸， 慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP 力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。 力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。 （2）各种骨骼疾病如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、 各种骨骼疾病如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、 骨转移癌和骨折修复愈合期等，由于骨损伤或病变使骨细 骨转移癌和骨折修复愈合期等， 胞内高浓度的ALP释放入血，引起血清ALP升高。 胞内高浓度的ALP释放入血，引起血清ALP升高。 ALP释放入血 ALP升高
问题 酶活力的测定就是测定酶促反应的速 度。本实验的酶促反应速度是如何测 定的？ 影响酶促反应速度的因素很多。本实 验是如何控制各种因素对酶促反应速 度的影响的？ 对于无可见光吸收的被测物，如何使 用可见光光度计进行测定？实验中又 是如何消除各种新增加因素的影响的？
掌握酶活性测定的一般方法 掌握酶活性测定的一般方法
熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法 血清碱性磷酸酶活性的测定
掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义
如何测定酶活性的大小? 如何测定酶活性的大小
酶活性： 酶催化某一化学反应的能力， 酶活性： 酶催化某一化学反应的能力，其 衡量的标准是酶促反应速度的大小。 衡量的标准是酶促反应速度的大小。
适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法最常用的方法10二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物这种二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物这种方法又可分为
血清中碱性磷酸酶活力的测定
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单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠 玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得 其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其 分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到达这个限度时，或许已经不纯粹作用于演示，极大可能运用于阅读领域；无论是传播观 点、知识分享还是汇报工作，内容的详尽固然重要，但请一定注意信息框架的清晰，这样才能使内容层次分明，页面简洁易读。如果 您的内容确实非常重要又难以精简，也请使用分段处理，对内容进行简单的梳理和提炼，这样会使逻辑框架相对清晰。为了能让您有 更直观的字数感受，并进一步方便使用，我们设置了文本的最大限度，当您输入的文字到这里时，已濒临页面容纳内容的上限，若还 有更多内容，请酌情缩小字号，但我们不建议您的文本字号小于14磅，请您务必注意。单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为 了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更 多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人 带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到 达这个限度时，或许已经不纯粹作用于演示，极大可能运用于阅读领域；无论是传播观点、知识分享还是汇报工作，内容的详尽固然 重要，但请一定注意信息框架的清晰，这样才能使内容层次分明，页面简洁易读。如果您的内容确实非常重要又难以精简，也请使用 分段处理，对内容进行简单的梳理和提炼，这样会使逻辑框架相对清晰。
碱性磷酸酶比活性测定实验报告
碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶（ALP）的比活性，了解其在生物体内的作用和活性水平。
通过实验，掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法，培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化磷酸酯的水解反应。
在本实验中，以对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚（pNP）和磷酸。
pNP 在碱性溶液中呈黄色，其在 405nm 波长处有最大光吸收。
通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化，可以计算出碱性磷酸酶的活性。
比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数，通过测定蛋白质含量和酶活性，即可计算出碱性磷酸酶的比活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠（pNPP）碳酸钠碳酸氢钠缓冲液（pH 100）氢氧化钠溶液（1mol/L）考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品（组织提取液或细胞培养液）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液：分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液，加入到 10ml 容量瓶中，用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度，得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。
长处测定各标准溶液的吸光度。
绘制标准曲线：以 pNP 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）配制考马斯亮蓝 G-250 试剂：将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml。
配制牛血清白蛋白标准溶液：将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。
实验 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定【参考仅供】
I (吸光度)
IO
代表：有色物质对光的吸收能力
医学参考A
33
Lambert定律： A∝ L
Beer定律：
入射光
IO
A∝ C
合并Lambert-Beer定律：
A ∝ C •L
即：A ＝ K • C • L
摩尔吸光系数
医学参考A
透过光
CI
L
34
在同一实验条件下，分别测定待测物溶液吸 光度（A测）和标准物溶液吸光度（A标），两者 均符合Lambert-Beer定律。
27
2、得率
每一制剂中总的酶活性单位
得率 =
溶液A中总的酶活性单位
×100%
医学参考A
28
3、纯化倍数
每一制剂AKP比活性（U/mg）
纯化倍数 =
溶液A制剂AKP比活性（U/mg）
医学参考A
29
AKP分离纯化小结表：
总体积（ml） 蛋白含量（mg/ml） 总蛋白量（mg） AKP活性单位（u/ml） 总AKP活性单位（u） 比活性（u/mg） 纯化倍数 得率
计算蛋白质含量：
各制剂总蛋白含量（mg） = 查表所得值 ×稀释倍数 × 总体积
注： A2、B2、C2液分别稀释 50、50、5 倍
医学参考A
26
③ 各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算
1、AKP比活性：
每ml制剂中AKP活性单位数（U）
AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中蛋白质含量（mg）
医学参考A
酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞
医学参考A
10
③ 选择合适分离提取方法
把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分 子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉
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应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P 式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶，
Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同，
Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
• 问题3：
• 在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速 度都可以代表酶活性？
清在37℃。pH=7.4的条件下与底物作用60min，生成1μmol 丙酮酸所需的酶量为1个活力单位
• 酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活 力单位数，即酶活力浓度。
• 酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法）
C 目 录 O N T E N T S
• • 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊
断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液， 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清 碱性磷酸酶明显升高。
什么是ALP?
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类 底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去 磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有 什么意义？
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。
血浆酶的来源
血浆酶
血浆特异酶
外分泌酶
非血浆特异酶
3.1 3.05 3.0 2.9 2.8 2.7
碳酸盐缓冲 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 液
0.5%铁氰化 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 钾溶液
相当于金氏 0 单位
0.5 10
20 30 40
立即混匀，选择波长510nm，用零号管调零，读 取各管吸光度，然后将以上各管所得读数与其 相应的碱性磷酸酶单位(依次为0 .5、10、20、 30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。
更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。
4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血 单击此处可编辑内容，
1
根据您的需要自由拉
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2
根据您的需要自由拉
伸文本框大小
伸文本框大小
血清应分别作对照管
5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久 置
计算
• ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白） *0.05*100(金氏单位）
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种 方法又可分为：
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实 验方法）。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对 硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。
• 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定 在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
• 对于固定时间法，需在酶作用一段时间后，加入合适的 终止剂终止酶促反应。
• 尽量去除各种抑制剂
• 问题5：
• 如何表示酶活性大小？
酶活性单位
• 定义：
• 在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物 （或得到一定量的产物）所需要的酶量。
• 分类：
• 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 • 国际单位(International unit, IU)：指在规定条件
• 金氏单位定义
• 每100ml血清在37℃与底物作用15分钟，产生1mg酚为1个 金氏单位。
• 参考值 成人：3~13金氏单位 儿童：5~28金氏单位
临床意义：
血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床 辅助诊断指标。
1．血清ALP活性升高可能原因如下 ：①肝胆疾病：阻塞性黄 疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于 骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血 液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、 佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。
• 连续监测法： （速率法）
• 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
• 适用于自动生化分析仪 • 能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂
用量少，可在较短时间内完成测定。
酶偶联测定法
2．血清ALP活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢 性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。另有一种遗传性低ALP 症，因成骨细胞中缺乏ALP，引起骨中的矿物质严重缺乏， 易发生骨折。
标准曲线法
加入物（ml) 0
12
345
酚标准应用 0 液
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1ml=0.1mg
蒸馏水
（2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
•问题2：
• 如何测定酶活性？
酶活性的概念
【注意事项】
1、 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的 作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。
2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色， 说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。
单击编辑标题
3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终 单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体， 止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。
（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1mol底物 的酶量。单位为IU/L 。 • Kat单位：指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶 量，1Kat=6×107IU。
• 酶的活力单位
国际单位：Katal，1s转化1mol底物的酶量 临床表示：Kings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml血
叁 ·实验器材与试剂
• （一）器材：
5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式
移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒
温水浴
淡黄色结晶。熔点 109℃。溶于水、苯
和乙醇，微溶于乙
醚。
• （二） 试剂：
1、碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解无水碳 酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g。4-氨基安替比林 1.5g于蒸馏水800ml中，将此溶液转入1L容量瓶内， 加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。
• 酶活性：酶催化某一化学反应的能力
• 常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位 时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法）
• 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀 剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产 物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
细胞内酶
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• 它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
酶促反应进程曲线
•能够真正代表酶 活性大小的是线 性期的酶促反应 速度，即酶促反 应初速度。
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
• 问题4：
• 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择
• 合适的底物与最适底物浓度 • 底物浓度远远高于酶浓度 • 理想的缓冲液与最适离子强度 • 最适温度 • 最适pH • 合适的辅因子、激活剂浓度 • 合理的测定时间
肆 ·实验操作
实验过程两次水浴保温，一次5min，一次15min。前者是达 到最适温度，后者是反应时间
取试管4支，按下表操作
• 立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水 调零点，读取各管吸光度。 •保持反应时温度是均衡的，37°C
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2、20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 ห้องสมุดไป่ตู้，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿 2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再 倒回瓶中）
4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰 化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾 用量必须加足或稍稍过量
壹 ·实验目的 贰 ·实验原理 叁 ·实验器材与试剂 肆 ·实验操作
壹 ·实验目的
• 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法（磷酸苯二 钠法）
• 掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义
贰 ·实验原理
• 测定ALP活性的方法主要分为两种
• 一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如 β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的 缺点
• 在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。 • 1.分泌酶： • 来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶
（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（LPS）、 胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。 • 正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化 作用。 • 在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有 关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。 例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。