色谱峰,色谱柱与参数
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死时间 (dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色
谱柱的时间。在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积 (dead volume,V0)-- 由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占
据的空间。它包括 4 部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被
流动相占据, Vm )、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm 参与色谱平衡过程,其它 3 部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这 3 部分体积应尽量减小。 V0= F×t0(F 为流速)
梯度方法的建立:
Rs 1a -1k
(
a
) N () 41k
k(t G F / 1.15V m)
Rs:分离度,表示两峰分离程度的物理量。
k:容量因子,表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比,在等度洗脱中。
一种物质的 k 值是恒定不变的。上面两试针对的是梯度洗脱,k 表示的平均容量因子。
a:分离因子,两个溶质的容量因子的比。通常 k 大的作为分子。表示两物质分离
能力的大小。
N:理论塔板数,表示柱子的分离能力,也就是柱效。
t G:梯度时间;F:流速; V m:死体积;:梯度变化范围。
常见问题和维护:
整个液相系统最值得关注的常数:压力
除体系受到污染之外,几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。
压力来源:泵上的压力传感器
最常见的问题:
压力小(几乎为零):说明没有流动相流过柱子。
可能原因:
柱前漏夜
流速设为 0 了
流动相干了
吸滤头没有放流动相液面之下
流路中有大段气泡
处理方法:
漏液:从泵的出口到柱子的前端接口(柱后漏液几乎不会影响压力值)顺次检查。泵上有自己的漏液传感器。检测到漏液。会停止工作并蜂鸣,变红。同时显示错
误信息: ERROR:LEAK DETECTED 。发现漏液点,先停泵,重新接好。将漏
液擦干。
有的漏液不明显,这时压力的也不会太小,检查时要注意,可用手仔细摸各个接口,感觉是否湿冷。
流路中有大段气泡:
通过大流速(如5ml/min )冲洗可以去除泵体内气泡。也就是常说的PURGE。
按下泵的面板上的purge 键即可。每次 PURGE 的时间和流速可以在面板上设定。
通常不改。初始值应该是5ml/min , 3min。
但有时候泵体内空气太多, purge 都不可以,或者很难抽上流动相,这是可以在purge 的同时,用注射器,在泵的废液出口处抽。直到没有气泡。
关于偶尔出现的气泡,不用太过在意,因为:
1.有脱气机在。
2.在 purge 时,由于流速太大,难免会出现气泡。尤其是在purge 阀开超过 180
度,废液出口处出现气泡就跟平常了。
3.只要气泡不在泵腔内堆积,就几乎不会影响到分析结果。只要出了泵口,在
高压下会
被压缩的很小。不影响流路的延续性。
所以,只要观察压力变化,如果压力没有异常波动,就行。在泵体内有气泡堆积
时,压力波动会变大。什么样的波动算正常,需要大家注意观察。根究经验,在
以恒定流速,梯度不变时,面板上以 MP 为单位的显示值应该几乎不变。
频繁出现的气泡会影响到流路的延续性,应该注意。吸滤头堵,管路脏(通常是
水相)有可能带来频繁出现的气泡。可以先 A ,B 的溶剂瓶调换一下。 PURGE 三五次。后换回来,再 PURGE 两次。清洗一下管路。
压力过大:说明流路堵了
逐段排查,先从柱(预柱)前接口(因为柱子最易堵)断开,以一定流速走:
压力正常,说明是柱子及其后的某一段堵了(通常是柱子)。换柱子(或预柱)。压力还高:说明是柱前某段堵了。
这时再将进样器出口(接柱子)的peek 管接头拧下:
压力正常:说明是这段peek管堵了。换 peek 管。
压力还高:说明是进样器之前的部分堵了。通常是进样器六通阀堵了。反冲或清
洗流通阀。
其它部分依次类推。
压力波动大:说明流路中的液流不平稳,这时色谱图通常保留时间不稳定,峰型也不好。得到的线性,重复性也不会好。
可能原因:泵体内有气泡,泵头单向阀坏。
先确认是哪一台泵有问题。先走100%A 相。看是否压力还是波动大,还大则说
明A 泵有问题。压力正常则说明 A 泵正常。再走 100%的 B 相,过程如上。确认
好泵之后,先 purge 一下,以驱赶气泡。 Purge 两次后,还是压力波动大,这有
可能单向阀坏了,需要清洗或更换。
Ctc 自动进样器的常用维护操作(实验室现场操作):
换针:
调针位:
调针位:
设定洗针体积:
一些小概念:
PEEK:聚醚醚酮
色谱管道,外径多为 1/16inch,1inch=2.54cm,1/16in=2.54cm,内径大小以颜色
标准,红色(我们用的)最小,为 0.13mm(应该是国际统一标准)
PEEK 接头手紧即可
不锈钢接头要用工具紧
接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。后者在拧紧的过程中,不易带动管
道扭曲变形。
不锈钢的压紧环是一次性的
单位换算:
1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psi
Psi:pound per square inch (psi)
Torr:托里彻利,标准大气压的1/760。也就是 mmHg(毫米汞柱)
其它问题:
残留大:
很可能是洗针过程有问题,注意观洗针时有没有抽上液体,抽上来的液体是否有很多气泡。出现过由于转子磨损,洗针液不能顺畅流出进样口。造成洗针不充分。清洗或更换转子。
也可能进样过程有问题,注意观察进样针活塞是否推到底。可能由于流通阀堵塞,造成压力大,进样针没法推到底。
重现性不好:
内标波动大,可能喷雾针脏了,使得喷雾不均匀。可能是液相方法没有开发好。
峰型差,峰太宽都有可能造成面积不重复(不会差别太大)。
注意观察重现性不好的那几针,是否峰型比较特殊,保留时间也有较大变化,如
果是,很有可能是由于 pump 里进了气泡,造成流速不稳,这点可以从压力变化得
到确认,但是好像没法记录压力曲线。