基因治疗PPT课件

一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
LTR
Neo Target gene LTR
ψ Ampr
oriE
常用逆转录病毒载体的结构示意图
（五）重组逆转录病毒的制备
1．包装细胞 (1)包装细胞定义 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转 录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的 一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病 毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒 自身缺乏包装信号（ψ 序列）而不能包装,不产生 病毒颗粒。
转导细胞的筛 选与鉴定
利用标记基因和目的基因的表达产物 利用核酸分子杂交
回输体内
考核疗效和安全性
基因治疗与基因工程的比较
基因工程
1. 目的基因
应用或研究基因
2. 载 体
(原核或真核)
3. 靶 细 胞
原、真核
4. DNA体外重组
√
5. 重组DNA导入宿主细胞 √
6. 后处理
√
基因治疗 标志基因+治疗基因
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
象外科移植手术，切除病变部分，换上正 常健康基因，这在目前还难以做到
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
4.基因水平，对付外源基因入侵，在原核生物
中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。
对于内源基因突变: 至今未找到令人满意的治疗方法。 基因治疗仅仅处于初始阶段。 全世界接受基因治疗者106人，受试者600人
一、基因治疗的概念
定义：
广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物， 治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗 是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转 移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
2．基因组结构
图11-3 逆转录病毒基因组的基本结构

(三) 逆转录病毒载体结构功能特点
保留病毒的LTR ,ψ ,去除病毒的结构基因,加上 一个抗性标记基因
LTR
Neo
ψ Ampr
LTR oriE

(四) 重组逆转录病毒载体结构
保留病毒的LTR ,ψ ,用目的基因和抗性标记基 因置换了病毒的结构基因
(真核) 真核
√ √ √
第三节 基因转移技术
转移基因方法
生物学方法
非生物学方法
①逆转录病毒载体
①磷酸钙共沉淀法
②腺病毒载体
②质粒DNA/脂质体法
③腺相关病毒载体
③电击法
④单纯疱疹病毒载体
④受体介导转移法
⑤注射法
以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射 法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）
基因治疗
第一节 概 述
人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变 （如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。 机体对外来侵袭抵御体现在以下4个层次：
1.整体水平，诸如动物的打斗撕咬；
2.细胞水平，如Mφ 对“异已”吞噬作用； 3.分子水平，如抗原抗体反应，人可以产生106
抗体分子，对付外来侵袭；
Hale Waihona Puke Baidu二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
基因干预 (gene interference)
在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义 RNA、核酶、三链DNA及干扰RNA技术
三、基因治疗中的靶细胞
生殖细胞: 优点——治本 困难——①生殖(学)生物学问题，极其复杂且不清楚。 ②伦理学问题
名人精子库”，“美女卵子库”，总是别人的 “种”，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必 然，爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出 租车（不是说开出租车不好，特此声明）
⑧多种肿瘤细胞
四、基因治疗的途径
1.间接体内疗法（ex vivo） 体外将治疗基因→靶细胞内,再将经基因修饰靶
细胞→病人,使这种外源基因(细胞)在体内表达， 从而达到基因治疗目的.(目前多采用这种疗法)。 2.体内法(in vivo)
外源基因→直接导入体内有关组织器官→进入相 应组织器官进行表达→从而达到基因治疗目的。
善疾病的一种治疗手段。
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
（二）逆转录病毒的基因组结构
1.一般特征 (1)正链RNA病毒 即与mRNA极性相同（5‘→3’），反之为(一)； (2)5‘有m7Gppp帽，3‘有poly（A）尾； (3)病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链cDNA分子→细胞核并 整合到宿主染色体,这种整合病毒DNA称为前病毒(provirus)(不 管是源于RNA还是DNA)(并非所有逆转录病毒都致癌)。