《基因工程的基本操作程序》ppt

感受态细 胞吸收 DNA
1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作 B 为受体细胞，原因是 A．结构简单、操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少、简单 D．性状稳定、变异少 D 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④
编码区 非编码区
编码区上游
启动子
编码区下游
终止子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子 真核 细胞 的 基因 结构 编码区
内含子
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列 非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下 游有终止子
非编码序列： 包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 不同点 编码区是 连续 的 _____ 真核细胞 编码区是间隔的、 不连续 _____的
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。
(三)将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞：
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、酵母菌等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
受体细胞 内，并且在 转化——目的基因进入_________ 稳定 和_____ 表达 的过程 受体细胞内维持_____
2014-4-9
27
(三)将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 导入植物细胞 方法 基因枪法
1.过程: （1）用一定的_________ 限制酶 切 割质粒，使其出现一个切口， 黏性末端 露出____________ 。 （2）用同一种限制酶 ___________切断目 的基因，使其产生相同 _____ 的黏性末端 ____________。
切口 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ，形成了一个重组 处，再加入适量___________ DNA分子（重组质粒）
思考：
比较PCR体外扩增技术与DNA复制的 异同点？
练习册P9
3、人工合成目的基因
逆转录法
目的基因的信使RNA
逆转录酶
化学合成法
蛋白质的氨基酸序列
推测
单链DNA
DNA聚合酶
信使RNA序列
推测
双链DNA （目的基因)
基因的核苷酸序列
人工合成
目的基因
1、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术 扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利 用化学方法人工合成 D A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
返 回
1、用β-珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是 A A．镰刀状细胞贫血症 B．白血病 C．坏血病 D．苯丙酮尿症 2 、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基 因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 B A．用于检测疾病的医疗器械 B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C．合成β-珠蛋白的DNA D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序：
目的基因表达载体提纯 显微注射 受精卵 取卵（受精卵） 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：
源自文库
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
(四)目的基因的检测与鉴定 ①导入检测：目的基因是否导入受体细胞 方法—— DNA分子杂交 分 检测 转录检测——分子杂交 子 检 ②表达检测 测 翻译检测——抗原抗体杂交 法 抗虫鉴定 鉴定 抗病鉴定
个体水平的鉴定
活性鉴定等
知识延伸——DNA分子杂交技术
该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链 DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或 化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的 同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
1、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码子 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别 2、目前转基因工程可以 C A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离
编码区和具 都由能够编码蛋白质的______ 相同点 有调控作用的非编码 ______区组成的
基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________
DNA引物； 四种脱氧核苷酸； 热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
• 方式
指数 方式扩增， ：以_____ 即____ 2n （n为扩增循环的次数）
“变性、退火、延伸” 三步 过程： 曲
变性：加热至90～ 95℃双链DNA解链成为 单链DNA
退火：冷却至55～ 变性 60℃部分引物与模板的 单链DNA的特定互补部 位相配对和结合 延伸：加热至70～ 75℃以目的基因为模板， 合成互补的新DNA链 退火 延伸
2、基因表达载体的组成：
目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自 的作用是 什么?
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部 位，有了它才能驱动基因转 录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能终 止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细 胞筛选出来
原核细胞的基因结构(补充内容） 非编码区 编码区上游 启动子 编码区 非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
原核 细胞 的 基因 结构 编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断 ①不编码蛋白质。
非编码区 ②调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区
花粉管通道法
导入动物细胞 ——显微注射法 导入微生物细胞 —— 感受态细胞吸收 DNA分子
28
1、将目的基因导入植物细胞 特点: （1）农杆菌 转化法
能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
转化过程:
表 植 农 Ti质粒 构建 达 转入 插入 植物细胞 表达 新 导入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞
3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在 基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达
4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因 的做法正确的是 C ①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白 的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的 DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精 卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入 细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ 5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 C ①农杆菌转化法 ②基因枪法 ③花粉管道法 ④显微注 射法 ⑤胚胎移植 ⑥DNA分子杂交法 A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤ C．①②③④ D．①③④⑤⑥
3、目的基因主要是指_______________ 的结构基因。 编码蛋白质 获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中 核苷酸 序列，基因在 获取目的基因，根据基因的_________ 染色体 上的位置，基因的________ 转录 产物mRNA，基 ________ 因的_______ 表达 产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用 PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在________ 体外 完 成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的 ________ 核苷酸 序列，以便于合成_________ 引物 。（3）如果基 因较小且核苷酸序列已知，可以通过____________ 人工合成 方 法。
基因文库
基因组文库 部分基因文库(CDNA文库)
基因文库
基因组文库
部分基因文库(CDNA文库)
基因组文库的构建 某生物体内全部DNA
限制酶
cDNA文库的构建
某种生物某个时期的mRNA
反转录 cDNA
与运载体连接 导入
许多DNA片段
与运载体连接 导入
受体菌群体
受体菌群体
基因组文库
部分基因文库 （cDNA文库）
例如：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、 植物抗病基因等
2、获取目的基因的常用方法 （1）从基因文库中获取
（2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生 物不同基因的许多 DNA片断，导入到 受体菌的群体中， 各个受体菌分别含 有这种生物的不同 基因，称为基因文 库。
思考与探究：
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分 析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导 入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都 可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙 酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 （趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA 转移并插入到染色体DNA上。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术。通过此技术使其 数量呈指数方式增加，可获取大量的 目的基因。
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料： 一段已知目的基因的核苷酸序列（模板DNA）
二、基因表达载体的构建——核心
基因表达载体的作用：
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可
以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码 序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么 部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基 因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
③基因组文库和部分基因文库比较
（3）如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。
1、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库 的描述正确的是
C
A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个 生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文 库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文 库
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器 功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若 要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网 和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在 于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大 肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。