动物细胞培养

动物细胞与组织
动物细胞培养
应用领域
a生产单克隆抗体和疫苗。
b组织与器官再生、培养。
c动物细胞基因工程
动物细胞培养生产的生物制品
（1）病毒疫苗：乙肝疫苗(HbsAg)、脊椎灰质炎疫苗(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)等。
（2）非抗体免疫调节剂：干扰素（IFN ）、白细胞介素（IL ）、 B 细胞生长因子（BCGF ）、巨噬细胞激活因子（MAN）、 T 细胞替代因子（TRF）等等。
（3）多肽生长因子：神经生长因子（NGF ）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、血清生长因子（SF）等。
（4）酶类：组织血纤维溶酶原激活剂（t－PA ）等。
（5）激素：红细胞生成素（EPO）、促黄体生成素（LH）、促滤胞素（FSH）等。
（6）肿瘤特异性抗原：癌胚抗原（CEA）等。
（7） 单克隆抗体（ MCAB ）。
（8）病毒杀虫剂：杆状病毒等。
（9）皮肤移植：单细胞培养等。

动物细胞的特点
动物细胞与微生物细胞相比，主要有以下不同：
（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。
（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。
（3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。
（4）动物细胞间主要以聚集体形式存在。
（5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。

动物细胞（组织）培养：是从动物体内取出细胞（或组织），模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞（或组织）生存、生长并维持结构和功能。
体外培养
体外培养可分为原代培养（亦称初代培养）和传代培养（亦称继代培养）。
原代培养：指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞
从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。

体外培养种类：细胞培养、组织块培养、器官培养
培养器具：
A. 不同大小的T-培养瓶和一只卡氏瓶。
B. T-培养瓶架（下）和卡氏瓶架（上）。
C. 一种卡氏瓶的规格（毫米）。
D. 国内常用的几种培养瓶。
动物细胞（组织）培养的生长特性
粘附型细胞 ：粘附生长本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。
粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。
动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。
体外培养细胞类型：1 成纤维型、2 上皮型、3 游走型、4 多形型
（一） 成纤维细胞型细胞
外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规

则形。前者贴壁后呈长梭形，圆形细胞核位于中央，胞质外伸出2－3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。
多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。有时也相互平行排列，成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。
（二）上皮型细胞
类似上皮细胞的细胞，特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状”，局部可以单层的上皮状“膜片组织”。
皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。
（三）游走型细胞
分散生长，一般不连接成片形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则。
该类细胞不很稳定，外形不规则且不断变化，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。
表现这种细胞形态的主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。
（四）多形型细胞
多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。
多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。

影响细胞形态的因素
能够影响细胞形态学特征的主要因素包括：血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。形态会因条件而改变
非粘附型细胞
体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。
一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。
血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。
悬浮型细胞培养特点：
1、悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。
2、这种方法有多方面的优越性，易于大规模生产，便于过程的控制。
3、可惜能在悬浮状态下生长的细胞种类有限，且不太方便观察。



动物细胞培养的基本技术
体外培养的条件
A与微生物细胞培养相比动物细胞培养的特殊性
B大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。
C动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。
D对于培养环境的

适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。
E动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。
F对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。
影响因素
细胞系的建立:由初代培养产生, 能进行无限次传代培养的细胞群。
（一）温度
与多数哺乳类动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37℃，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。
（二）pH
细胞培养的pH最适为7.2－7.4之间，当pH低于6或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡。
（三）气体
细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的O2及CO2足以保证细胞体内代谢活动的进行，但作为代谢产物的CO2在培养环境中还有另一个重要作用：即调节pH的作用 。
（四）营养
动物细胞的培养对营养的要求较高，往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子等，其中很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供，在很多情况下还需加入10％的牛胚胎浸出液或新生牛血清。
培养基
天然培养基：动物血清、组织提取液、鸡胚胎汁等
优点：营养价值高
缺点：成分复杂、来源有限、成本较高
小（胎）牛血清——蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、多种生长因子等成分。
合成培养基
优点：成分已知、易控制
缺点：无法替代一些未知成分
解决途径——合成培养基中添加小牛血清，彼此互补
无血清培养基
血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分
血清培养基缺点：对后期产物的分离、提纯及检测造成干扰。来源有限、成本较高
无血清培养基：试图全部替代血清成分，尤其是生长因子（例如胰岛素）、激素（例如生长激素）等。
其它动物细胞培养必需的溶液
1 平衡盐水（BBS）：生理盐水+葡萄糖 调节渗透压 PHHanks溶液
2培养基pH调整液：调整PH 7.4%NaHCO3 ，HEPES溶液
3细胞消化液
用途：从组织块消化分散得到单个细胞 传代培养时分散细胞
胰蛋白酶溶液 ：水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：解离细胞
两者常结合使用，增加效果
4抗生素溶液：防止微生物污染。
常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。
一般配制成母液，使用时稀释。
动物细胞培养技术
3个主要阶段
（一）原代（初代）培养期
指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。
（二）传代期
原代培养

细胞一经传代后便该称为细胞系，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。
（三）衰退期
该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。
原代培养与传代培养
1培养对象的获得
2初代培养——组织块培养
3传代培养——消化法
一般传代培养的步骤
(1) 吸出培养瓶内旧培养液。
(2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。
(3) 2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细胞质回缩现象，终止消化。
(4) 吸出消化液，加入Hanks液，轻轻转动以免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。
(5) 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。
(6) 重新接种培养。
建系过程
肿瘤细胞的体外培养与建系过程
以人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程：
（1）取材
用鼻咽活检钳从一鼻咽癌患者的鼻咽部肿物获得。
（2）原代培养
1） 鼻咽部肿物组织放入含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小时。
2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。
3） 于37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养。
（3）建系过程
组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。
用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为CNE-2。CNE-2经生物学特性分析后确定细胞系建立成功
动物细胞大规模培养
1 基本流程
2 生物反应器系统
（1）生物反应器设计依据：除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。
（2）分类
一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等。
（3） 动物细胞培养的载体
实现规模化急需解决的问题
问题一 细胞贴壁生长的载体
微载体培养技术
微载体是直径60-250μm的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或

介质，以利于细胞的贴壁及生长。
*贴壁培养的载体材料与生物反应器系统
主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。
后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊
*一种微载体产品及孔状的显微结构
（4）生物反应器培养系统与工艺
问题二 系统构建
问题三 传代技术
问题四 培养工艺
（5）培养工艺——连续灌注培养
一个问题：怎样实现接种传代培养？？
球传球技术
（5）应用举例
生物反应器培养非洲绿猴肾细胞和狂犬病毒
1材料与方法
（1）细胞：非洲绿猴肾细胞Vero细胞(ATCC):150-180代。
（2）培养基：DMEM(Dulbecco sModified EagleMedium, GIBCOL)，加5%～10%小牛血清和硫酸庆大霉素，用碳酸氢钠或盐酸调至pH7.0～pH7.2。
（3） 微载体：CT-3微载体。
（4）反应器：5LCellGen细胞培养反应器，50LCellCul-50A细胞培养生物反应器
2培养过程
以CelliGen5L细胞培养反应器作为种子罐培养，当细胞生长到一定密度时，将细胞和新的微载体一起移入CellCul-50A细胞培养反应器中 。自动控制：温度37±0.1℃、溶解氧为50%空气饱和度、转速为20～32rpm。
细胞培养到一定密度后，接种狂犬病毒。第2天停止搅拌，抽出培养基，加病毒培养基继续培养。病毒培养条件为pH7.4～pH7.8、溶解氧为40%～60%空气饱和度、温度为37.0℃。
3培养结果
培养8天，细胞密度达1.1×107cells/ml。细胞贴附在微载体上生长的电镜照片见图。在整个培养过程中细胞形态饱满光滑、长较快，细胞在较短的时间内达到高密度，且可多层生长。接种病毒后10天，能产生较高的病毒量。
贴附在微载体上的细胞
动物细胞体外培养
现状与展望
存在的问题
细胞密度低，产物浓度低。
细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物活性易降低。
动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。
目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。
在线监测水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。
今后应重点开展的工作
细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理论研究。
开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。
开发细胞生长性能优良、细胞解离容易，并能重复使用的新型廉价的微载体。
研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌生物反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与自动控制技术等。
相关基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。