细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
细胞冻存（缓存）
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可
吹打脱落。
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。
（冻存细胞程
序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为
宜。
）
细胞复苏（速溶）
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。
根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
计算存活率
取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％。
细胞复苏标准操作规程
细胞复苏标准操作规程一、准备工作在进行细胞复苏之前，需要做好以下准备工作：1.准备细胞复苏所需器材和试剂，包括细胞培养瓶、细胞复苏试剂、培养基、离心管、移液管、离心机等。
2.清洗实验器材，消毒处理，确保无菌环境。
3.计算细胞复苏所需剂量和浓度，为后续操作做好准备。
二、细胞复苏前消毒在进行细胞复苏之前，需要对细胞培养基和器材进行消毒处理，以确保细胞生存环境的安全：1.将细胞培养基和器材放入高压锅中进行高温高压消毒。
2.清洗干净细胞培养瓶，确保无残留物。
3.加入适量细胞复苏试剂，以备后续使用。
三、细胞复苏细胞复苏是将冷冻保存的细胞进行复苏解冻的过程，具体操作如下：1.将细胞培养瓶放入37℃恒温水浴中，轻轻晃动培养瓶，使试剂与细胞充分接触。
2.放置于适宜温度下培养，一般需要培养至细胞融合完全。
四、细胞计数和存活率检测在细胞复苏后，需要对细胞进行计数和存活率检测，以了解细胞的生长状态和存活情况：1.收获培养好的细胞，用离心机进行离心分离。
2.计数细胞并检测存活率，可以使用血球计数板或流式细胞仪进行计数和存活率检测。
3.记录所得数据，包括细胞数量、存活率等。
五、细胞传代和扩增在细胞生长至融合完全后，可以进行细胞的传代和扩增，以获得更多的细胞数量：1.将部分细胞进行传代培养，加入适量细胞培养基，置入37℃恒温水浴中。
2.培养一段时间，至细胞融合完全。
3.继续进行细胞的传代和扩增，直至达到所需的细胞数量。
六、细胞质量检测在细胞传代和扩增过程中，需要对细胞的形态、结构和数量进行检测，以评估细胞的质量：1.观察细胞的形态和结构，包括细胞的形状、大小、边缘等特征。
2.对细胞的生长和繁殖情况进行观察和分析，包括细胞的分裂速度、生长曲线等。
3.通过检测细胞的各项指标，综合评估细胞的质量和适用性。
七、记录和整理在细胞复苏、传代和扩增过程中，需要对各项数据进行记录和整理，以便对细胞的生长状态和质量进行评估：1.对每一步操作进行详细记录，包括操作时间、操作人员、操作步骤等。
细胞生物操作规程(3篇)
第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。
二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。
2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。
3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。
4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。
三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。
2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。
传代过程中，注意无菌操作，避免污染。
3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。
4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。
四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。
2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。
3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。
五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。
2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。
六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。
2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。
3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。
七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。
2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。
八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞冷冻及复苏操作流程
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细胞冻存与复苏 步骤PDF.pdf
书山有路细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。
细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。
2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养1。
细胞冻存与复苏 步骤
细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min 离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。
细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。
2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。
②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。
二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。
其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。
标准操作规程(SOP)——细胞的保存和复苏
一、目的细胞的冻存和复苏是细胞培养的基本技术之一。
利用冻存技术可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞的保存和复苏。
三、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2，详见生物安全个人防护SOP 。
（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞：80%～90%成片，细胞生长良好，存活率高2．二甲基亚砜（DMSO ）(Singma CatNo D-5879)3．胎牛血清（GIBCO CatNo 16000）4．EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na ）（GIBCO CatNo 25300）5．D-MEM 培养液（含有L-谷氨酰胺）（GIBCO CatNo 11965）6．无菌移液管：1mL ，10mL7．37 ℃恒温水浴箱8．细胞生长液（见MDCK 细胞培养SOP ）9．70%～75%的酒精（三）实验步骤1．细胞冻存（1）冻存液的配制：9mL 胎牛血清，1mL 二甲基亚砜。
（2）细胞消化：用EDTA-胰酶消化细胞，具体步骤参见MDCK细胞培养标准操作规程（SOP ）——SOP中的细胞消化过程。
（3）细胞消化后，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。
（4）细胞冻存浓度为1×106/mL。
℃，-70℃过夜，放入液氮长期保存。
℃，-20 2h（5）细胞冻存过程：4 0.5h2．细胞的复苏冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞死亡。
细胞活化后，需要数日或继续传一至二代，其细胞特性才会恢复正常。
（1）将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70%～75%的酒精擦拭外壁后放入生物安全柜内。
（2）配戴防护面罩、防冻手套，从液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧。
（3）立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，用70%～75%酒精擦拭冻存管外部，移入生物安全柜内。
细胞冻存及复苏步骤
细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。
（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。
2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。
注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。
加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。
3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。
4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。
5.离心800r每分钟，4min。
在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。
细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
背景知识:细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要.细胞冷冻储存在—70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达—196℃，理论上储存时间是无限的。
原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容(操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2。
离心机3。
恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、—20℃、—70℃)5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7。
液氮冰箱易生物仪器库：http://www.ebioe。
com/yp/product—list-42。
html（二)玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2。
培养瓶3. 玻璃瓶(250ml、100ml）4。
废液缸（三）塑料器皿1。
吸头2。
枪头3. 胶塞4。
移液管(10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1。
微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5。
移液枪（五）试剂1。
D—Hanks液2。
小牛血清3。
培养液4. 双抗(青霉素、链霉素）5。
胰蛋白酶(0。
08％)6。
1NHCl7。
7。
4％NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：http://www.ebioe。
com/yp/product-list—43.html二、操作步骤(一）细胞冻存1。
配制含10％DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏高博，苏州大学医学部药学院药理学系冻存（1）传统方法：冷存管置于4℃，10 min→ -20℃，30 min→ -80℃ 16～18 h（或隔夜）→液氮罐长期储存。
-20℃不可超过1 h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/min之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮罐中长期储存。
适用于悬浮型细胞与杂交瘤之保存。
一、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，终浓度为10 %，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞传代培养操作，收集培养细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1 ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
二、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（对数生长期，logphase）且存活率高之状态，约为80～90%致密度。
（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（3）注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22 micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
甘油（Glycerol）亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
复苏1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1 min之内融化。
2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
细胞复苏SOP
济源市疾病预防控制中心文件编号：作业指导书第 1 页共1页第1版第1次修订起草人：王军鹏审核人：标题：MDCK细胞复苏标准操作规程批准人：批准日期：2013年12月18日实施日期：2013年12月18日1. 范围适用于实验室所有技术人员进行MDCK细胞的复苏操作。
2. MDCK细胞复苏程序2.1 生物安全要求MDCK细胞复苏实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 37℃恒温水浴箱；2.2.2 细胞生长液；2.2.3 胎牛血清1mL；2.2.4 T-25培养瓶，无菌移液管;2.2.5 70％～75％的酒精;2.2.6 15mL无菌离心管;注意事项：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。
2.3 实验步骤2.3.1 将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70％～75％的酒精擦拭外壁，放入生物安全柜内.2.3.2 自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，避免热胀冷缩过程盖子松掉。
2.3.3 立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，以70％～75％的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜内；在解冻过程中，需做好个人防护，防止冻存管爆裂。
2.3.4 取出1.0mL解冻的细胞悬液，缓慢加入到预先加有5mL细胞生长液的15mL离心管内，1000rpm，离心5min，弃去上清，用5mL细胞生长液重悬细胞，移入细胞培养瓶内，放入37℃ 5%CO2培养箱培养。
注意事项：复苏细胞的原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成损害，从而导致细胞死亡。
新复苏的细胞一般需要数日或继续传代1~2代，其细胞生长或细胞特性才会恢复正常。
3．说明3.1整个试验过程要防止MDCK细胞污染。
3.2保持MDCK细胞的敏感性。
4.技术依据WS285-2008《流行性感冒诊断标准》附录A、B。
细胞冻存和复苏标准操作规程
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
细胞冻存与复苏方法
细胞冻存与复苏方法细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
一、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
二、慢冻程序1、标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25 ℃以上时，1~2 ℃/min；当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。
3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。
三、低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法1、预先配制冻存液10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
液氮长期保存五、保存细胞的复苏方法1、快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
传代细胞的冻存与复苏SOP
1. 目的规范细胞的保存与复苏方法。
2. 范围各种细胞的保存与复苏3. 职责3.1.质量管理部：负责本程序的起草。
3.2.质量管理部QC人员：负责本程序的操作。
3.3.总经理：负责本程序的审批。
4. 定义无5. 引用标准无。
6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1. DMEM培养基6.1.2. 细胞消化液6.1.3. 二甲基亚砜6.2. 仪器设备低速离心机、液氮罐6.3. 器械、用具细胞冻存管、小试管7. 流程图无8. 内容8.1. 细胞保存8.1.1. 将细胞按常规进行消化。
8.1.2. 将消化好的细胞加入小试管中。
8.1.3. 500～1000rpm离心10分钟资料整理8.1.4. 倒掉上清，加入已配制好的细胞保存液中（含10%二甲基亚砜的细胞生长液）8.1.5. 轻轻吹打将细胞悬起，倒入细胞冻存管中。
8.1.6. 做好标记（包括细胞名称、细胞代数、冻存日期）。
将冻存管放入带绳的纱布袋中。
8.1.7. 将纱布袋放入4℃冰箱中预冷2小时。
8.1.8. 再放入-20℃冷冻柜中预冻2小时。
8.1.9. 然后放入液氮中。
做好记录。
在绳上做好标记。
8.2. 细胞的复苏8.2.1．配制细胞生长液8.2.2．准备一杯40℃左右的温水8.2.3．将准备复苏的细胞管从液氮中取出快速放入40℃左右的温水，使其以最短的时间融化。
8.2.4．500～1000rpm低速离心10分钟。
8.2.5. 倒掉上清，用已配制好的细胞生长液将细胞悬起。
8.2.6．转入细胞培养瓶中。
37℃培养。
8.2.7．于次日细胞贴壁后，换掉液体。
9. 注意事项9.1．随时注意观察液氮罐中液氮液面，少于三分之一时及时添加。
9.2．从液氮中取出细胞时，注意不要冻伤。
9.3．把握细胞慢冻快融的原则，细胞复苏后的存活率比较高。
10. 附录及派生记录10.1. 无11. 相关文件无12. 修订记录。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
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背景知识：
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：
一、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
易生物仪器库：/yp/product-list-42.html
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
易生物试剂库：/yp/product-list-43.html
二、操作步骤
（一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
三、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
四、细胞复苏
在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为同行提供些参考。
【材料】
1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。
2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。
【操作程序】
1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。
3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。
7.记录复苏日期。
【注意事项】
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min 内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。
因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。
5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。