微生物植酸酶在体外条件下活性的测定_石宝明

微生物植酸酶在体外条件下活性的测定

东北农业大学动物营养研究所 石宝明　单安山

由于添加无机磷导致粪便中磷的排出量增

多,污染水源和土壤,同时磷酸氢钙还易导致氟中

毒和其他重金属中毒,因此在饲料中添加植酸酶

代替直接添加无机磷日益受到重视。植酸酶的应

用效果,关键在于其在消化道中的活性。自然界

有许多不同的植酸酶来源,通过遗传工程技术,利

用微生物(黑曲霉—A spe rgillus nige r)发酵工程技

术生产饲用植酸酶,已成功地应用于猪和家禽中。

本试验是应用这种微生物植酸酶,以玉米、豆饼、

麦麸为植酸磷载体,模拟畜禽胃肠消化道环境,在

体外条件下测定微生物植酸酶的活性。

1　材料与方法

1.1　试验材料　微生物植酸酶,由德国BASF公司提供。

1.2　试验设计

1.2.1　时间与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度为40℃,加入pH为5.5的乙酸溶液10mL和0.1g植酸酶,振荡混匀,在催化时间分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h后,加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。

1.2.2　温度与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,加入pH5.5的乙酸溶液10mL和0.1g植酸酶,振荡混匀,在催化温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃下,反应4h后加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。

1.2.3　pH与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度40℃,加入0.1g 植酸酶,振荡混匀,然后分别加入pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的乙酸溶

液10mL,反应4h后加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置干燥箱中烘干,烘干后用TCA法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。

1.3　计算方法　植酸磷降解率(%)=(催化前载体中植酸磷含量-不同催化条件下植酸磷含量)/催化前载体中植酸磷含量×100。

2　试验结果

2.1　时间与微生物植酸酶的活性　微生物植酸酶在不同催化时间下,对饲料中植酸磷的降解率见图1。

图1　不同催化时间对微生物植酸酶活性的影响

从图1可以看出,微生物植酸酶对植酸磷的降解率随着催化时间的增加而增加,在4h后为80%,在5～6h后基本完全降解。

2.2　温度与微生物植酸酶的活性　微生物植酸酶在不同温度下,对饲料中植酸磷的降解率见图2。

图2　不同温度对微生物植酸酶活性的影响

从图2中可以看出,微生物植酸酶的活性,随着温度(25～70℃范围内)的增加而增强。在pH

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2000年第15期 中国饲料DOI:10.15906/ 11-2975/s.2000.15.012

维生素B 6分光光度测定方法的改进

新疆农业大学 杨开伦　雒秋江　李玉梅　潘竟丽

维生素B 6(VB 6)包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆

胺,被动物吸收进入机体后,经过磷酸化作用分别转化为磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺,而且这3种形式之间也可相互转化。它们在动物体内主要参与蛋白质、脂肪和碳水化合物的代谢,尤其作为转氨基反应的一种辅酶,参与体内的多种氨基酸代谢,同时它对动物体的免疫功能也起一定的作用。VB 6的缺乏,会影响动物机体对营养成分的吸收,引起动物神经系统调节紊乱、皮炎、贫血等症状,是动物和人体的必需营养物质。有关VB 6的定量测定方法有微生物法、HPLC 法和比色测定法。微生物法费时又不能准确定量;HPLC 法虽然能准确定量,但需要昂贵的仪器设备;比色测定法测定VB 6时,虽然显色很快(约1min ),但稳定性很差,定量范围较窄(3～8μg /mL ),且所需样品体积和试剂量较大,操作繁琐。为此,我们进行了不同反应介质下显色速度及产物稳定性的研究,在此基础上提出了一种测定VB 6的改进方法。其基本原理是VB 6与2,6二氯醌氯亚胺反应生成蓝色靛酚,在650nm 处有最大光吸收值,VB 6浓

度在一定范围内符合朗伯-比尔定律。1　材料与方法

1.1　试剂1.1.1　显色剂　称取40mg 2,6二氯醌氯亚胺(上海试剂总厂第三分厂),用异丙醇溶解定容到100mL ,摇匀,贮于棕色瓶中放置冰箱保存(可在一个月内连续使用,如果变成粉红色不可再用)。测定时取25mL 于100mL 的容量瓶中,用异丙醇定容,配成浓度为0.01%的工作溶液(当天配制当天使用)。

1.1.2　氢氧化铵—氯化氨缓冲液(3.2%)　称取16g 氯化氨溶于70mL 蒸馏水中,加浓氨水16mL ,再用蒸馏水定容至100mL 。临用前用水稀释成浓度为3.2%的溶液。1.1.3　标准VB 6贮备液(100μg /mL )　准确称取盐酸吡哆辛(上海化学试剂公司分装厂,标示含量99%)标准品25mg (预先在硅胶真空干燥器中干燥4h ),用0.1mol /L 盐酸溶解并定容至250mL ,为5.5、时间4h 的条件下,温度在50～60℃时,饲料中植酸磷的降解率接近100%,在40℃下降解率为80%。

2.3　pH 与微生物植酸酶的活性　微生物植酸酶在不同pH 下,对饲料中植酸磷的降解率见图3

。

图3　不同pH 对微生物植酸酶活性的影响 从图3可以看出,微生物植酸酶有一个很宽的pH 范围,pH 值为2.5与5.5时活性最强,即有2个最适pH 值2.5和5.5。在pH 为7.0时,微生

物植酸酶的活性很低。3　分析和讨论

本试验通过模拟畜禽胃肠道环境,在体外条件下,以玉米、豆饼、麦麸为植酸磷的载体,考察了时间、温度和pH 对微生物植酸酶活性的影响。试验结果表明,微生物植酸酶在40℃、pH 为5.5条件下,4h 以上对玉米、豆饼、麦麸中植酸磷的降解率为60%～100%。在温度为40℃、pH 为2.5、时间4h 的降解率为60%。在健康状态下,猪和家禽消化道温度为40℃左右、pH 为2～7,其中胃中pH 为1.5～2.5,小肠pH 为5.5左右,饲料通过消化道时间为3～12h 。由此可以看出,以玉

米豆粕型为基础日粮的鸡、猪等单胃动物,饲料中的植酸磷,在消化道内容易被微生物植酸酶降解。

(参考文献略)

[通讯地址:哈尔滨市香坊区,邮编:150030]

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24—中国饲料 2000年第15期