PCR引物的设计原则

PCR引物的设计原则：

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为18~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.碱基随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物之间

两引物之间不应具有互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dN TP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，2 5s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错配下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

11. 引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

12. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

13. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应该对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

关于BLAST（使用方法以后将会讲解）的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

下面我们调用PRIMER PREMIER 5.0（以primer premier 5.0为例），讲解它的特点和使用方法，目的是要达到能够自己设计一对简并引物、可以分析一段序列或基因的酶切位点。