免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组织化学染色技术
03 免疫组织化学染色技术的 操作流程
样本的收集与处理
01Βιβλιοθήκη 0203样本类型
免疫组织化学染色技术可 应用于各种组织样本，如 石蜡切片、冰冻切片、细 胞涂片和组织块等。
样本处理
在染色前，需要对样本进 行适当的固定、脱水、包 埋和切片等处理，以确保 抗原的完整性和活性。
样本标记
在切片过程中，需对组织 进行标记，以便后续的定 位和观察。
04 免疫组织化学染色技术的 优化与改进
抗体选择与优化
总结词
抗体选择是免疫组织化学染色技术的关键步骤，直接影响到染色结果的特异性和敏感性。
详细描述
在选择抗体时，应考虑抗体的来源和生产过程，以确保其质量和可靠性。同时，应选择针对目标抗原具有高亲和 力的抗体，以提高染色结果的特异性。此外，可通过实验验证抗体的最佳工作浓度，以实现最佳的染色效果。
染色结果的检测与评估
染色结果的检测与评估是免疫组织化学染色技术的最后步 骤，也是最为关键的一步。检测方法包括显微镜观察、图 像分析等。评估染色结果时，需要综合考虑染色强度、阳 性细胞的数量和分布等因素，以得出准确的结论。
染色结果的检测与评估对于病理诊断、肿瘤研究等领域具 有重要意义。通过免疫组织化学染色技术，可以检测组织 中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断和治疗提供 有力支持。
抗原修复与阻断
抗原修复
通过加热或化学方法使抗原从组织中 暴露出来，以便抗体能够与其结合。
阻断
为了防止非特异性染色，需要用阻断 剂对组织进行阻断，以消除内源性过 氧化物酶和生物素等物质的干扰。
抗体孵育与洗涤
抗体选择
根据研究目的选择特异性抗体，确保其能够与目 标抗原特异性结合。
抗体孵育
免疫组织化学染色技术PPT课件
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
免疫组织化学染色技术
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
免疫组织化学染色技术
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荧光素-抗体标记
❖ FITC-IgG（蛋白）
技术类型
❖ 直接染色法 ▪ 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)
❖ 间接染色法 ▪ 荧光素标记第二抗体（Ab2) ▪ 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）
直接法
❖ 优点 ▪ 简单 ▪ 特异
实例：细胞鉴定
❖ 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） ▪ T细胞 • CD3+
荧光素
❖ 异硫氰酸荧光素（FITC）
黄绿色荧光
520-530 nm
490-495 nm
荧光素
❖ 四乙基罗丹明（RB200）
橘红色荧光
625 nm
540 nm
荧光素
❖藻红蛋白（PE）
488-561 nm
578 nm
荧光素
❖别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC ）
660 nm
650 nm
免疫组织化学染色技术
李会强 医学检验学院
Email:lihuiqiang1965@
组织化学染色技术
❖ Histochemistry Technique
❖ 观察对象
▪ 组织、细胞
❖ 使用工具
形
态
▪ 普通显微镜
与 结
▪ 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
❖ Immunohistochemistry Technique ▪ 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位 通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反 应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。
标本类型
❖ 组织标本 ▪ 冰冻切片 ▪ 石蜡切片（脱蜡和水化）
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法：直接法原理和操作流程
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法原理和操作流程
一、原理与意义
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——直接法，是一种荧光抗体染
色法。
该方法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较
高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。
此法每种荧光抗体只能检
查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
二、操作流程
1、染色：切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧
光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
2、洗片：倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2 PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
3、用50%（用0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固，并镜检
拍照。
4、对照染色
①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。
②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血
清（相同）等量混合，如上法处理切片。
结果应为阴性。
为证明此种
染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。
此法结果较二步法稳定。
③类属抗原染色试验，前面已作叙述。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学染色方法
免疫组织化学染色方法
免疫组织化学染色方法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
该方法利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，通过特定的染色反应可将该蛋白质定位于细胞或组织的特定位置。
免疫组织化学染色方法有多种类型，其中最常用的是免疫荧光染色和免疫酶标记染色。
免疫荧光染色利用荧光标记的二抗或直接标记的一抗来检测目标蛋白质，观察结果需要使用荧光显微镜。
免疫酶标记染色利用酶标记的二抗或直接标记的一抗来检测目标蛋白质，观察结果需要使用光学显微镜。
免疫组织化学染色方法在病理学、生物学、医学等领域中得到广泛应用，可以用于诊断疾病、研究生物学机制等方面。
该方法具有高特异性、高灵敏度、高分辨率等优点，但也存在某些局限性，如可能出现假阳性或假阴性结果、技术要求较高等。
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免疫组织化学—突触素Syn染色
DAB染色方法考察对SYN-1的影响1) 将冰冻切片室温放置30min；2) 0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）3) 枸橼酸pH6.0水浴95℃热修复5min，冷却至室温；4) 0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）5) 放入3%H2O2浸泡10min以除去内源性过氧化物酶；6) 0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）7) 放入0.5﹪Triton X-100中5 min；8) 0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）9) 滴加5%的BSA室温30min；10) 加SYN-1或DCX一抗(1：100)孵育脑片，放入湿盒4℃过夜；11) 0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）12) 加入相应二抗，湿盒内室温放置30min；13) 0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）14) 擦干水分，滴加SABC，予湿盒内室温放置30min；15)0.01PBS (pH7.2~7.4)震荡漂洗每次5min，共3次；（可用摇床）16) DAB显色，水洗；（显色时间根据显微镜下实时颜色控制）17) 酒精脱水，二甲苯透明；（上行：80%酒精15s-30s;95%酒精15s-30s;无水酒精Ⅰ30s-60s;无水酒精Ⅱ1min-5min），二甲苯透明（上行：二甲苯Ⅰ1min-2min;二甲苯Ⅱ2min-5min;二甲苯Ⅲ5min-10min）；18) 中性树胶封固，镜检；注：染色过程中不可干片，需保持染片湿润，BSA血清封闭时间可根据自身情况调整，如果高温孵育可视情况用保鲜膜封住，以防蒸干0.01MPBS配方：1L:NaCl(8.5g)+Na2HPO4.12H2O(3.3g)+NaH2PO4.2H2O(0.4g)3L：NaCl(25.5g)+Na2HPO4.12H2O(9.9g)+NaH2PO4.2H2O(1.2g)，PBS最好现配现用枸橼酸pH6.0缓冲液：柠檬酸缓冲盐（包装上有规格配比）溶于蒸馏水，可保存一段时间3%H2O2：30%H2O2(20ml)+100%CH3OH(180ml)，比例：1:90.5%TritonX-100：100%Triton(2ml)+0.01MPBS(398ml) DAB显色液：蒸馏水(1m)+A、B、C显色液各一滴。
2015-免疫组织化学染色方法
(2)蛋白酶的种类 胰蛋白酶0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等
量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化 时间37℃ 30min。
胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.01N HCI稀 释，消化时间37℃ 30～180min。 蛋白酶K 20μg/ml，用pH8.0 0.5M TrisHCI配制，消化时间37℃ 20～40min。
1.直接测定法
一抗稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:500 阴性对照
特异性染色 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ (－)
非特异性染色
++ ++ ++ + (－) (－)
2.棋盘法
3.抗体稀释液 抗体稀释液是从事IHC 工作实验室必备，其制备方法如下：1克 明胶(红、绿)溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS 中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后， 加入1克牛血清白蛋白和100mg NaN3，4℃ 保存。
主要内容
一、实验的设计 二、石蜡切片的脱蜡至水 三、内源性酶的消除方法 四、IHC的非特异性染色 五、抗原的暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项 七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制
一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的
IHC指标，根据经费情况，选择相 关公司购置特异性抗体和检测试剂。
免疫组化染色技术
概述
免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备 优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法， 稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或 标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC 前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背 景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的 脱片。
免疫组化抗体选择及常用染色方法
免疫组化抗体选择及常用染色方法一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
二、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。
S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2次。
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免疫组化的相关知识！
一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)
免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
四、免疫组化实验用抗体的选择
1、一抗选择要点
(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。
(2)种属来源。
一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。
这条主要要与后面的二抗来源相匹配。
(3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。
这一点很重要，一般说明书
上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。
(4)能否做免疫组化。
一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。
(5)检测标本类型。
用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。
(6)生产厂家。
国外著名抗体生产商原装抗体质量一般没问题，如R&D,ABCAM,
(7)价格与质量的矛盾。
我个人认为一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差(若时间长)，但价格较贵。
2、二抗选择要点
(1)种属来源。
主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)标记物的选择。
有HRP、Biotin、荧光素等标记物。
一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应；而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。
这主要与后面有无三抗和三抗种类有关。
(3)选择IgM还是IgG。
一般一抗是IgM，那么二抗就选择IgM；反之，一抗是IgG，则二抗选择IgG。
五、免疫组化常用的染色方法有哪些
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
免疫组织化学染色方法 IHC染色方法有很多种，按部标记物的性质可分为荧光法(荧光素标记)，酶法(辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，免疫金银及铁标记技术等;按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步，三步或多步法);按结合方式可分为抗原-抗体结合，如PAP法和标记的葡聚糖聚合物(labeled dextran polymer,LDP)法，以及亲和连接，如ABC 法、标记的链亲和素-生物素(labeled streptoavidin-biotin ,LSAB)法等，其中LSAB是最常用的使用方法。
影响免疫组化染色质量的因素很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当的选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。
由于组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低、或固定剂的使用不当及抗体质量不佳和稀释度不当等可出现假阴性反应;反之，由于抗体与非待检抗原发生交叉反应，或组织对抗体的非特异性吸附及内源性过氧化酶(endogenousperoxidase)没有被阻断等还可出现假阳性结果。
这些可造成判断的失误。