多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的

通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下:

多酚氧化酶

邻苯二酚(儿茶酚)，1?2 O ——————? 邻醌， HO 2 2

三、材料、仪器及试剂

1. 材料:马铃薯块茎等

2. 仪器:UV,1206或UV,1240分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵或匀浆机;试管;移液管;纱布袋等。

,13. 试剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP);0.01mol?L pH 6.5磷酸缓冲液;0.1m

mol?L,1,1pH6.5磷酸缓冲液;0.05 mol?L pH5.5磷酸缓冲液;30%饱和度硫酸

铵;0.1 ,1mol?L儿茶酚;

20,三氯乙酸。

四、实验步骤

1. 粗酶液的制备

称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏,1水浸洗，然后过滤以除去杂质)和100ml 0.1mol?LpH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加,1

硫酸铵使达60,饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2,3ml 0.01mol?L pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2. 活性酶的测定

,1,1在试管中加入3.9ml 0.05 mol?L pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol?L

儿茶酚在37?恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液(可视酶活性增减用量)，迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1,2min内测定吸光度变化(A)值。

五、酶活性的计算

以每min内A值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力525

和比活性。

A 酶提取液总量(ml)

,1 酶活力(0.01A?min),———————×———————————

0.01×反应时间测定时酶液用量(ml)

A 酶提取液总量(ml)

,1酶的比活性(0.01A?gFw?min)=————————×——————————

0.01×W×反应时间测定时酶液用量(ml)

公式中:A —为反应时间内吸光度的变化值;W为样品鲜重(g)。