多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定及控制[文献综述]

毕业论文文献综述生物工程多酚氧化酶活性测定及控制1 前言多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。

鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。

抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。

一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。

本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。

2 主题部分2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例）2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。

适合需大量制样时使用）将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。

C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。

称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。

【1】2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。

向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。

【2】2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）（1）将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，4。

茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定解析

实验一茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定（3学时）一、目的要求1、通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。

2、理解酶活性测定常规方法及一般原理。

二、基本原理茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。

多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH 条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。

反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2 02 --------------------- > 邻醌 + H20三、仪器及试剂1、材料：茶树鲜叶。

2、仪器：72 1 型分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3、试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）; 0.1M磷酸缓冲液（pH6.5）;硫酸铵；1% 邻苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M 尿素溶液或20%三氯醋酸。

四、操作步骤1、粗酶液的制备：称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵（或匀浆机）中，加入2g不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1M pH6.5 磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。

将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2、活性酶的测定：取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1M pH6.5 磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37C恒温水浴中保温10min,立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

多酚氧化酶活性的测定

五、实验结果记录：以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位（u）
A 410 V T W V S 0 . 01 t
多酚氧化酶活性

[ u （ g min ） / ]
式中：A410：反应时间内吸光度的变化， W：样品鲜重g， t：反应时间min， VT：提取酶液总体积ml， Vs：测定时取用酶液体积ml。
三、仪器与试剂 0.5%邻苯二酚溶液、 0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0、试管、恒温水浴、分光光度计等
四、实验方法： 1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。 2.酶液的制备：称取样品5.0g，用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至100ml，在18-20℃下浸提30分钟，中间摇动数次，过滤备用。 3.测定：（1）对照：在含有6mlpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1ml0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1ml灭酶后的酶液，2ml蒸馏水，以此调零。（2）样品测定：在含有6mlpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1ml0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1ml酶液，反应5分钟，加热灭酶以终止反应，以5000r/min离心10分钟，取上清液备用。在410nm下测定吸光度。
实验多酚氧化酶活性ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ测定
一、实验目的：
掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。
二、原理与方法多酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD 值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。

多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。

二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。

由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。

把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。

精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。

用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。

由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。

所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。

研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。

四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。

贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。

2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。

3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书微量法货号：BC0195规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系本公司工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体100mL×1瓶4℃保存粉剂粉剂×1瓶4℃保存试剂一液体20mL×1瓶4℃保存试剂二液体5mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。

产品说明：PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一200200试剂二5050样本50煮沸的样本5037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。

充分混匀，5000g，常温离心10min，收集上清，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。

国标测土壤多酚氧化酶分光光度法

国标测土壤多酚氧化酶分光光度法简介：多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，简称PPO）是一种存在于植物和动物组织中的酶类，广泛参与了许多生物体的物质代谢过程。

土壤中的多酚氧化酶在有机物的降解和土壤养分循环中发挥着重要的作用。

国家标准（GB21605-2008）中规定了利用分光光度法测定土壤多酚氧化酶活性的方法。

原理：该方法主要基于土壤中多酚氧化酶的活性，对酚类底物在多酚氧化酶作用下进行催化氧化反应，生成酚醌类产物。

通过测定产物在特定波长下的吸光度变化，进而确定多酚氧化酶的活性。

实验步骤：1.准备土壤样品：收集需要研究的土壤样品，并根据实验要求进行处理和干燥；2.制备土壤提取液：将土壤样品加入磷酸盐缓冲液中，并通过振荡或超声等方法进行充分混合；3.离心提取液：待提取液沉淀后，取上清液并将其离心；4.提取液的酚类物含量测定：将提取液加入含有酚醌类底物的溶液中，并在特定温度下进行反应；5.测定吸光度：根据特定波长下产生的酚醌类产物吸光度变化进行测定；6.计算多酚氧化酶活性：通过计算吸光度变化量，结合实验条件和标准曲线等数据，计算得到多酚氧化酶活性。

注意事项：1.样品的处理和提取过程应严格控制，避免对多酚氧化酶活性的影响；2.实验操作需要在一定温度下进行，以保证反应的准确性和可重复性；3.实验过程中需要使用吸光度计等仪器设备进行测量，确保所得结果的准确性。

优缺点：这种多酚氧化酶分光光度法在土壤中多酚氧化酶活性的测定中具有许多优点。

首先，操作简便，不需要复杂的设备和条件，适用于中小型实验室。

其次，该方法具有较高的灵敏度和特异性，能够准确地测定土壤中多酚氧化酶的活性。

此外，该方法还具有较好的重复性和可靠性，能够满足土壤生态学和环境科学中对多酚氧化酶活性的测定需求。

然而，该方法也存在一些不足之处。

首先，该方法对土壤样品的处理和提取过程较为敏感，需要仔细控制操作条件，以避免对多酚氧化酶活性的影响。

其次，由于该方法只能测定土壤样品中多酚氧化酶的总活性，对于活性的来源和特定酶类的测定有一定限制。

多酚氧化酶活性测定

A值变化均匀的三组数值求平均值。
多酚氧化酶活性测定多酚氧化酶多酚氧化酶的测定多酚氧化酶活性多酚氧化酶的测定方法多酚氧化酶活力的测定nadph氧化酶活性测定单胺氧化酶活性测定黄嘌呤氧化酶活性测定酶促褐变
实验一
多酚氧化酶（PPO）活性测定
末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端，把电子传递给O2的酶。 1、细胞色素氧化酶 2、交替氧化酶 3、酚氧化酶: 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶。 4、乙醇酸氧化酶 5、抗坏血酸氧化酶
四、实验步骤： 1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 5000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。 2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。 3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。 4．计算酶活力。按下式计算 PPO活性＝U/min gFW A值增加0.001定义为一个酶活力单位。
一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。三、器材与试剂 1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计 2、试剂：儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液 3、材料：马铃薯

多酚氧化酶的实验报告

1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。

2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。

3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。

本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。

三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。

2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。

2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。

向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。

将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。

3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。

五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。

3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。

1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。

2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。

七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。

多酚氧化酶活性测

溶液配制
pH=7的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液的配制：1/C1mL, C1mol/L的KH2PO4+2.963*0.2/C2mL,C2mol/LNaOH+H2O 至10mL 0.1mol/L邻苯二酚溶液的配制：取1.1g邻苯二酚定容至100mL,保存，备用
酶的提取
从新鲜马铃薯块茎中提取多酚氧化酶：取新鲜马铃薯洗净去皮切丝,加入100mLpH=7.0的 0.1mol/L的预冷的磷酸盐缓冲液，在高速组织捣碎机中匀浆3min，使受伤组织中的多酚氧化酶从细胞中分离出来，过滤得到匀浆液,将匀浆液装入离心管中在4℃高速冷冻离心机中以 4000r/min离心15min,取出离心后的匀浆液，静置，分液，得到上清液即为粗酶液
多酚氧化酶活性测定
缓冲液的配制
0.2mol/L的邻苯二甲酸氢钾溶液的配制取2.042g邻苯二甲酸氢钾（204.2g/mol）固体，溶解，定容50mL NaOH溶液的配制及标定取0.8g氢氧化钠固体，溶解，定容至100mL （0.2mol/L），以酚酞为指示剂，用邻苯二甲酸氢钾溶液标定，设标定后氢氧化钠溶液的浓度为 C1mol/L 磷酸二氢钾溶液的配制取2.902g磷酸二氢钾（145.1g/mol）固体，溶解，定容至100mL，用C1mol/L NaOH溶液标定，设标定后磷酸二氢钾溶液的浓度为C2mol/L

பைடு நூலகம்
xmL0.2mol/LKH2PO4+ymL0.2mol/LNaOH+水至 20mL
pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 x 5 5 5 5 5 5 y 0.372mL 0.570mL 0.860mL 1.260mL 1.780mL 2.365mL pH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 x 5 5 5 5 5 5 y 2.963mL 3.500mL 3.950mL 4.280mL 4.520mL 4.680mL

多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]

毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。

在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。

同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。

2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。

面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。

2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。

2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。

2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。

抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。

2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。

多酚氧化酶实验报告

一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。

2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。

3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。

本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。

2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。

四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。

2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。

3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。

4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。

五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。

表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。

2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物、菌类和动物体内的酶，主要催化化学反应为将多酚氧化成醛或酮。

本实验旨在通过测定PPO的活性来了解酶的基本特性及其酶学性质。

一、实验材料1、经过离心沉淀的香蕉、苹果、洋葱原汁。

2、6%聚乙烯醇（PVA）溶液。

3、明胶溶液（1%）。

4、酚酞指示剂。

5、75mM bicine缓冲液（pH 8.5）。

6、0.05% 过氧化氢溶液。

7、1% 多巴胺溶液。

8、分光光度计。

二、实验原理多酚氧化酶是一种铜单子酶，催化剂的过程时首先将基质中的酚乙酸类化合物与氧气反应形成间醌，然后间醌的氧化、聚合，形成花青素、黑色素等产物。

本实验采用的基质是多巴胺（L-dopa），媒介是酚酞指示剂，测定体系的光学吸收度。

酶的活性按单位时间内反应的基质质量而计算。

三、实验步骤1、提取PPO将香蕉、苹果、洋葱各取50g，切碎，加入200ml 0.1M盐酸溶液，搅拌后放在4℃冷库20-30min，滤去上清液。

将残渣加入100ml冷水，搅拌，离心至沉淀物无明显色泽，取上清液后pH调节至8.5，保存于冷库。

2、测定PPO的活性（1）制备基质溶液：10mg多巴胺溶于2ml 0.1M的硫酸钠溶液中，用1M的NaOH溶液调节pH至8.5，加入12ml0.75M缓冲液，加水至50ml。

（2）制备酚酞指示剂溶液：2mg的酚酞溶于100ml的乙醇中，加水至1L，制成0.2%的酚酞溶液。

（3）测定反应系统：将基质溶液、酚酞指示剂溶液和一定量提取液混合，在25℃下恒温反应5min。

（4）实验对照：在上述条件下，仅加入基质溶液和酚酞指示剂溶液，无提取液作为实验对照。

（5）催化反应停止：加入0.5ml 的聚乙烯醇溶液。

（6）光度计测量：在650nm处上述反应体系产生的色素的吸光度。

4、结果计算将吸收度计算为1cm光程曲线的峰高比，用表格法计算多酚氧化酶活性反应速率以μmol/min为单位。

多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]

毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。

在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。

同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。

2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。

面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。

2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。

2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。

2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。

抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。

2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。

甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制

甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制一、本文概述本文旨在探讨甘薯中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）活性的测定方法，并深入研究如何控制甘薯在加工和储存过程中因PPO活性过高引发的褐变现象。

甘薯作为一种重要的农作物，其营养价值和经济价值均较高，但在加工和储存过程中，甘薯常因PPO的作用而发生褐变，这不仅影响了甘薯的外观品质，还可能降低其营养价值，甚至影响消费者的接受度。

因此，研究甘薯中PPO活性的测定方法和褐变控制技术，对于提高甘薯的加工品质和储存稳定性具有重要的理论和实践意义。

在本文中，我们将首先介绍PPO的基本性质及其在甘薯中的功能，然后详细阐述PPO活性的测定方法，包括常用的比色法、光谱法等。

接着，我们将分析甘薯褐变的原因和机理，探讨影响PPO活性的各种因素，如温度、pH值、抑制剂等。

在此基础上，我们将提出一系列控制甘薯褐变的策略和方法，如物理法、化学法和生物法等，并对各种方法的优缺点进行比较和评价。

我们将对甘薯中PPO活性的测定及褐变控制的研究前景进行展望，以期为甘薯的加工和储存提供更为有效的技术支持。

二、甘薯中多酚氧化酶的活性测定在甘薯中，多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是一种关键的酶，参与了甘薯褐变的过程。

为了更深入地了解甘薯褐变的机制并寻找有效的褐变控制方法，对甘薯中多酚氧化酶的活性进行精确测定显得尤为重要。

测定多酚氧化酶活性的方法主要基于酶催化底物氧化产生有色产物的原理。

在本研究中，我们采用了经典的邻苯二酚法来测定甘薯中多酚氧化酶的活性。

将甘薯样品进行匀浆处理，以获得含有多酚氧化酶的酶液。

然后，将适量的酶液与底物邻苯二酚混合，并在适宜的温度和pH条件下进行反应。

随着反应的进行，邻苯二酚被多酚氧化酶催化氧化，生成有色产物。

通过测定有色产物的吸光度，可以间接反映多酚氧化酶的活性。

为了获得准确的结果，我们在测定过程中严格控制了实验条件，包括温度、pH值、底物浓度和反应时间等。

多酚氧化酶的测定

多酚氧化酶活性的测定采用李军红等的方法，略加修改。

称取0.5g全麦粉，加入5ml,0.1mol/l,pH5.6的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液,4sheshidu提取过夜。

5000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

反应混合液为4ml提取缓冲液加1ml 0.1mol/l的邻苯二酚，对照不加邻苯二酚，以缓冲液代替，37sheshidu下精确反应15min，在722S分光光度计上读取420nm处的吸光值，A420读数增加1.00所需的酶量定义为一个酶活单位。

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH5.6、0.1mol/l：0.2mol/l磷酸氢二钠 11.6ml0.1mol/l 柠檬酸 8.4ml小麦多酚氧化酶火星的基因型、环境极其互作效应的分析胡瑞波，田纪春，吕建华。

中国粮油学报，2004年2月，第19卷第一期全麦粉离心法测定PPO活性，称取全麦粉0．50 g，加入柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH值6．0)5 ml，混匀后在4℃下过夜提取，于4℃、4000r／min离心15min。

取2ml缓冲液和0．5ml酶液于40℃水浴5min，再加入1 ml邻苯二酚，混匀后于420nm波长下测定15 min内吸光值的变化PPO 的活性(u)表示为△A×1000／min。

小麦多酚氧化酶特性及河边控制研究黄海霞，张真，吴金芝安徽农业科学008，36(31)：13574—13575，13638酶液的提取酶液的提取按Kruger 等和Taneja 等方法进行作了部分修改 .20粒小麦种子加5ml蒸馏水浸泡 25h左右 .全麦粉 5g加柠檬酸 -磷酸缓冲液 (ph6.8)50ml.搅拌静置反复几次20000g/4sheshidu离心 15min,取上清液于 4sheshidu冰箱保存备用活性检测活性检测按 Kruger等方法作了部分修改取 1ml酶液和 2ml邻苯二酚(0.1mol/l)于37sheshidu 水浴 5min,然后在比色皿中混合 ,405nm波长下测定 5min内吸光值的变化. PPO的活性表示为△A×1000／min。

多酚氧化酶活性测定

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的经过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。

用分光光度法在 525nm 波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。

反应式以下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2——————→邻醌＋ H2O三、资料、仪器及试剂1.资料：马铃薯块茎等2.仪器：UV－1206 或UV－1240 分光光度计；离心计；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3.试剂：聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）； 0.01mol ·L－1pH 6.5 磷酸缓冲液； 0.1mmol·L－1－1pH6.5 磷酸缓冲液； 0.05mol LpH5·.5 磷酸缓冲液； 30%饱和度硫酸铵； 0.1－1mol ·L儿茶酚；20％三氯乙酸。

四、实验步骤1.粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g 于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（早先用蒸馏水浸洗，尔后过滤以除去杂质）和100ml0.1mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液 ,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除积淀，上清液再加硫酸铵使达 60％饱和度，离心收集积淀。

将所得积淀溶于2～3ml0.01mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2.活性酶的测定在试管中加入 3.9ml 0.05 mol L－·1pH5.5 磷酸缓冲液， 1.0ml 0.1 mol L －·1 儿茶酚在 37℃恒温水浴中保温 10min，尔后加入 0.5ml 酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于 525nm 波长处以时间扫描方式，在 1～2min 内测定吸光度变化（ A）值。

五、酶活性的计算以每 min 内 A525 值变化 0.01 为 1 个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 -------------------------------- 邻醌+ H2O三、试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎。

2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 .试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L 磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min）5min,取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

多酚氧化酶活性的测定

多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶(POD)是一种酶类，广泛存在于植物、细菌和真菌等生物体中，具有氧化多酚的功能，可将多酚类物质氧化为其对应的醛酮或烯醇。

多酚氧化酶活性的测定是研究植物生理生态、农业及食品科学等领域的重要技术手段之一。

多酚氧化酶活性的测定方法有多种，常见的测定方法有单宁酸、苯胺、硫脲、芳香胺等底物的光度法、荧光法、色谱法和电化学法等。

其中，光度法测定多酚氧化酶活性是相对最简便、经济、有效的方法之一。

一、实验原理多酚氧化酶活性的测定原理基于多酚类物质的氧化反应，其反应方程式如下：多酚+ H2O2 → 多酚氧化酶→ 合成物 + H2O在光度法中，用苯酚为底物，通过苯酚酸化后生成背景吸光度，再将多酚加到反应体系中，多酚在酸性条件下与过氧化氢发生氧化反应，产生黄色的产物苯醛，可在310nm处检测吸光度增加。

二、实验步骤步骤一：制备反应液(1)苯酚称取1g苯酚溶于50ml0.1mol/L的钠碳酸中，加入2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至显红色终点，记录滴定体积，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至淡粉色的时间，同时记录滴定体积，测定得到苯酚的浓度。

(2)过氧化氢称取30%的过氧化氢溶液，在室温下稀释成0.04%过氧化氢溶液。

(3)缓冲液将0.2mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液(PH 6.0)浓度稀释成0.05mol/L。

(4)酶提取液在质量浓度等于1的0.05mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液中先加入1mmol/L的PEG6000，频繁将其混合均匀之后，再加入5%聚乙烯醇，在最后再加入一些几丁糖粉，并不断地搅拌混合均匀之后过滤清除残留物，提取所需酶液。

(1)标准液分别取0-40μmol/L的马尾松酚，加入0.1mol/L的硫酸调节pH至1，在0.1mol/L的缓冲液溶液中进行100μl反应，80℃下控制反应时间在5min在323nm检测吸光度，绘制标准曲线。

(2)样品处理将植物或细胞样品在工作台上用0.1mol/L的N/2 H2SO4溶解，然后过滤，用样品液稀释1倍。

多酚氧化酶的纯化和活力测定

多酚氧化酶的纯化和活力测定实验原理很多植物受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色，这是损伤时植物细胞破碎，原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。

反应如下：＋H2O多酚氧化酶＋1/2O2多酚氧化酶(po1yphenoloxidase，PP0)是一种含铜酶，它能够催化酚类物质转变成醌。

近几十年来，国内外对植物组织褐变的研究表明，组织的褐变主要是PP0作用于天然底物酚类物质所致试剂和器材一、试剂0.025mol/L磷酸钾缓冲液（ pH7.2）；0.15mol/L儿茶酚溶液；10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）；硫酸铵。

二、材料梨。

三、器材组织匀浆机，漏斗，滤纸，分光光度计。

操作方法一、多酚氧化酶(PP0)的提取1. 丙酮粉制备：取果肉组织100 g，加入200mL冰丙酮(—20℃左右)，用高速组织捣碎机匀浆5min，混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤，残渣用冰丙酮反复冲洗，过滤，直至成为白色粉末，此粉末即为丙酮粉。

2.酶液制备：称取1g丙酮粉，加入20ml 0.025mol/L磷酸缓冲液（ pH7. 2），0℃下用磁力搅拌器匀浆30min，在12 000rpm下离心30min，取上清液，得粗酶提取液。

二、多酚氧化酶(PP0)的纯化向上述酶液中加入NH4SO4至为80％饱和溶液，搅拌30min, 过夜，于12 000g离心30min，沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2）, 对10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）透析18h, 期间更换三次，即为纯化多酚氧化酶。

三、多酚氧化酶(PP0)活力的测定以儿茶酚为底物，在1cm的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2）， 0.1mL 0.15mol/L儿茶酚溶液，混匀，室温下放置3分钟后，加入0.1mL酶液, 5s后开始扫描1min内A420值的变化，酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。