化学_酶法合成多肽的研究进展

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性 物质 , 它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一 类化合物 , 由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过 肽键结合而成. 多肽类药物具有安全 、副作用小 、 用量小 (以 mg计 ) 、功能多样 、特异性强等特点 , 在细胞生理和代谢功能的调节上及抗肿瘤等方面具 有重要作用 [ 1 ]. 由于多肽的重要价值 , 人们正在不 断的探索人工合成具有生物活性多肽的方法.
在合成 TP25 中 Z2A sp 2Val2Tyr2OH 三肽时 , 由 于 A sp有两个羧基 , 若用化学法合成 , 氨基端和 β2 羧基均需进行保护和脱保护处理. 若采用酶法 , 则 由于酶的区域选择性使 β2羧基不需加以保护 , 从而 简化了反应步骤. L i等 [ 17 ]通过分析酶促合成肽的 原理和酶本身的特性 、底物种类及性质等 , 选择用 Val2Tyr2OH为亲核试剂 , Z2A sp 2OM e 为酰基供体 , 用碱性蛋白酶 alcalase酶催化合成了 Z2A sp 2Val2Tyr2 OH , 最后结合化学法成功地将剩余两个氨基酸缩 合到该三肽上. 在合成 TP25前体 B z2A rg2Lys2OH 二 肽时 , 由于 A rg2OEt对胰蛋白酶的活性位点有竞争 作用 , 所以选择无任何保护基的 Lys2OH 作为亲核 受体 , W ang等 [ 18 ]用动力学控制方法 , 在乙醇 / Tris2 HC l缓冲溶液 (80: 20, v / v)中用胰蛋白酶催化合成 此前体二肽 , 产率达 76. 1%. 2. 1. 2 细胞粘附位点 RGD 三肽 细胞粘附位点 RGD (A rg2Gly2A sp )序列肽作为拮抗剂可用于治疗 心血管疾病 、骨质疏松 , 预防和治疗由细胞粘附异 常而导致的肿瘤 , 促进损伤的器官与组织的再生 、 伤口的愈合等 , 因其具有广泛的生物学功能 , 所以 该类肽的粘附性可作为药物设计的一个新靶点.
化 Fmoc2氨基酸酯形成 Fmoc2氨基酸片段. 其合成 过程如图 1, 每步耦合产率均在 75% ～90%.
图 1 Fmoc2氨基酸片段合成示意图
Fig. 1 Schematic diagram of Fmoc2am ino acid fragments synthesis
2. 2 肽段缩合
化很困难. 而利用化学 2酶法缩合短肽片段的方式
逐步化学合成生物活性短肽的收率是令人满意 代替逐步法对产物的总收率及纯度均有明显提高.
的 , 但若超过 20个肽 , 副产物则迅速增加 , 分离纯 2. 2. 1 去氨加压素 N 端片段 去氨加压素 ( 12去
第 5期 武秀明等 : 化学 2酶法合成多肽的研究进展
化学 2酶法在合成多肽时取长补短 , 且由于酶 促肽的缩合反应避免了消旋 , 使其合成既可始于 N 端 , 又可始于 C端 , 明显优于纯化学法 . [ 11 ] 在合成 多肽时选择重要的中间体 , 如二肽和三肽等 , 利用 可溶性的保护基 , 结合化学法和酶法能进行大规模 肽合成 , 甚至可以连续进行 [ 12, 13 ]. 另外 , 化学 2酶 法耦合技术还可以将非天然活性肽段转化成活性多 肽 , 例如利用青霉素酰化酶对底物的专一性和特异 性先催化 D , L 2苯丙氨酸生成立体异构的二肽 , 再 经化学法环化为哌嗪二酮等 [ 14, 15 ] , 并且化学 2酶法 也是合成 光学 纯 的 α2氨 基 酸 及 衍 生 物 的 有 效 方 法 [ 16 ] .
其中 , 纤粘蛋白 ( Fibronectin)是由长达 2500个 氨基酸残基组成的一种暴露于细胞外的大分子糖蛋
白 , 可介导细胞对细胞外基质 ( ECM )的粘附作用 , 但其与细胞表面受体相互作用的决定性因素仅是一
个三肽序列 : RGD. 根据该三肽的化学结构特点 , Huang[ 19 ]和宋 明 媚 [ 20 ] 等 采 用 化 学 2酶 法 合 成 此 三 肽. 先利用简便且低廉的化学法经三步反应得到产 率较高的前体 Gly2A sp (NH2 ) 2二肽 , 然后在动力学 条件控制下用胰蛋白酶催化该二肽与 Bz2A rg2OEt 缩合形成 Bz2A rg2Gly2A sp (NH2 ) 2前体三肽. 化学 2
武秀明 , 周 成 , 王安明 , 张 俊 , 岑 涛 , 杜志强 , 沈树宝 3
(南京工业大学 制药与生命科学学院 , 材料化学工程国家重点实验室 , 南京 210009)
关 键 词 : 化学 2酶法 ; 肽合成 ; 肽段 ; 多肽衍生物
中图分类号 : O643. 3
文献标识码 : A
Jackson等 [ 25 ]在合成 RN ase A 过程中 , 融合了 化学固相片段的合成和酶催化片段的缩合. 先酶促 合成 RNase A 的 C端序列的 (982124) , 再固相合成 N 端含 iNoc基团的片段 (77～97、64～76、52～63、 21～52和 1 ～20 ) , 最后进行各片段间的缩合. 在 酶法合成 C端序列过程中 , 酰基供体酯的高效离去 基团能提高缩合反应速率 , 从而降低起始片段和终 产物被蛋白酶水解的危险. 同时 Phe2NH2改良的羧 酰胺甲酯的极好离去基团和使用过量的酰基给体片
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氨基 282D 2精 氨酸 2加 压素 , desmop ressin ) , 其序 列 为 : Mpa2 Tyr2Phe2Gln2A sn2Cys2Pro2D 2A rg2Gly2NH2 (Mpal2Cys6形成二硫键 ) , 是一种抗尿剂 , 用于治 疗糖尿病伴发的多尿症 、夜晚遗尿以及小便失禁 等 [ 24 ]. 大规模液相合成工艺中 , 常采用 [ ( 3 + 4) + 2 ]片段缩合策略. 其中 , N 端片段 Mpa (Acm ) 2Tyr2 Phe2NH 2NH2是 Mpa (Acm ) 2Tyr2OEt 和 H 2Phe2NH 2 NH2在糜蛋白酶催化下偶联的 , 这也是酶促偶联与 化学法相结合在工业生产中的具体应用. 2. 2. 2 RNase A 的 C端氨基酸片段 核糖核酸酶 A (RNase A )来源于牛胰脏 , 为内切核酸酶 , 可特异 攻击 RNA 上嘧啶残基的 3端’ , 能除去 DNA: RNA 中 未杂交的 RNA 区 , 也可用来确定 DNA 或 RNA 中 单碱基突变的位置.
2 化学 2酶法在合成多肽中的应用
2. 1 短肽片段的合成 短肽广泛存在于生物体内 , 具有很强的生物活
性 , 人工合成的短肽具有高效 、专一性 、易分离等 优点 , 可用于广谱性抗菌 、抗病毒 、抗肿瘤细胞的 药品开发 , 目前这方面的研究已深入到分子 、基因 水平 , 并能人工合成. 化学 2酶法在合成短肽方面已
目前合成多肽的主要方法有化学法 、重组 DNA 技术和酶法三种. 其中化学法包括固相合成 [ 2～5 ]和 液相合成 [ 6 ] , 该合成技术已较为成熟 ; 而重组 DNA 技术的应用因其研究和发展周期长 、成本昂贵 、产 品提取回收较困难等问题而受到很大限制 ; 相比之 下 , 酶法合成具有反应条件温和 、区域选择性高 、 毒性小等优势 , 因此发展相当迅速 , 并且近 20年来 科学家们已对酶法合成多肽作了广泛的研究 [ 7～10 ]. 酶促肽合成具有其不可替代的优势 , 但酶法研究起 步较晚 , 与化学法相比 , 因其反应周期长 、产率不 如纯化学法高等缺点使得仅依靠酶法进行肽合成远 不能满足于工业生产的需求. 而将酶法与化学法相 结合后用于肽类的合成将可以有效的避免二者的缺 点 , 达到减少反应步骤 , 提高效率 , 降低成本的目 的. 本文将从化学 2酶法在合成短肽片段 、缩合肽段 及合成多肽衍生物中的研究进展进行综述.
第 23卷 第 5期 2009年 10月
分 子 催 化 JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS (CH INA )
文章编号 : 100123555 (2009) 0520477205
Vol. 23, No. 5 Oct. 2009
化学 2酶法合成多肽的研究进展
酶法在合成此三肽的过程中 , 既避免了 A rg胍基保 护的麻烦 , 又直接得到了纯度较高的产物.
Huang等 [ 21 ]还首次利用化学 2酶法在微水 2有机 相中 合 成 了 细 胞 粘 附 位 点 RGDS 前 体 四 肽 Bz2 RGDS2NH2 , 他们在化学法合成 GDS2NH2的基础上 , 利用胰蛋白酶在微水相中催化 Bz2A rg2OEt前体三 肽缩合形成 B z2RGDS2NH2 , 产率在 68. 3%左右. 乙 醇作为该反应体系的有机溶剂既无毒熔点又低 , 很 容易从反应体系中除去. 并且该四肽在此微水 2有 机相中很难发生次级水解反应 , 有利用于产率的提 高和产品的提纯. 2. 1. 3 甜味天苯二肽 天苯甜二肽 (A spartame, α2APM )是一种比较理想的甜味剂 , 已有 80多个国 家和地区批准使用 , 因此降低成本提高收率成为科 研人员研究的重点. 许激扬等 [ 22 ]探索了天 2苯甜二 肽生产的新技术 , 以马来酐与 L 2苯丙氨酸甲酯为原 料化学法缩合生成马来酰 2L 2苯丙氨酸甲酯 , 并将 后者异构化成富马酰 2L 2苯丙氨酸甲酯 ( FPM ) , 收 率达 95% , 且马来酐价廉易得 , 具有生产可行性. 接着以 FPM 及 氨 或 氨 供 体 为 底 物 , 利 用 E. coli 8901为酶源 , 将 FPM 成功地转化为 α2APM , 尽管 产物浓度低 , 但作为合成 α2APM 的新思路及新方 法 , 具有重要的理论意义与探索价值. 2. 1. 4 Fmoc2氨基酸片段 Fmoc2氨基酸衍生物广 泛应用于固相及液相肽合成中 , 但 Fmoc2肽片段的 合成却鲜有报道. 一方面由于 Fmoc2基团遇碱不稳 定 , 在皂化过程中容易被水解 , 因此不能通过简单 的皂 化 Fmoc2氨 基 酸 酯 来 制 备 ; 另 一 方 面 因 为 Fmoc2氨基酸衍生物的侧链保护基团在酸性条件下 不稳定 , 所以也不能通过酸解 C 端保护基来得到 Fmoc2肽片段. 为避免上述不稳定因素 , 采用化学 2 酶法在温和的条件下水解 C端保护基制备 Fmoc2肽 片段是最好的选择之一. Chen等 [ 23 ]报道在高浓度 的乙醇或异丙醇等有机溶剂中用碱性蛋白酶催化皂
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分 子 催 化 第 23卷
有初步的研究和应用. 2. 1. 1 胸腺五肽 ( TP25) 胸腺五肽 ( TP25)是人工 合成的五肽 (A rg2Lys2A sp 2Val2Tyr) , 对应胸腺生成 素的 32至 36位氨基酸序列 , 具有天然胸腺生成素 的全部生物活性.
收稿日期 : 2008211225; 修回日期 : 2009202210. 基金项目 : 十一五国家 863项目 (No. 2006AA02Z211) , 江苏省自然科学基金 (No. BK2006181) , 国家自然科学基金 (20376034) ,
江苏省高校研究生创新计划资助项目 (2007). 作者简介 : 武秀明 (1984 - ) , 女 , 硕士研究生. 3 通讯作者 : Tel: 025 - 83587349, E2mail: zsbshen@ njut. edu. cn;
1 化学 2酶法合成多肽的特点
在化学合成肽中 , α2氨基 、羧基和各种侧链官 能团在合成前的保护和合成后的的脱保护是必不可
少的 , 也是最基本的耗时操作 , 并且还必须考虑一 直存在的消旋问题. 酶促肽合成与化学法相比具有 反应条件温和 、消旋作用小 、氨基酸侧链保护少和 立体专一性强等优点 [ 10 ] , 此外 , 区域选择性和立体 选择性也是酶法在肽合成中的两大优势所在 , 但单 从生物学方法考虑 , 该方法受到酶性质不稳定及产 率低等问题的限制 , 因此部分复杂多肽的合成必须 将化学法与酶法相结合才可实现.