干细胞基础与临床应用基础研究
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温应该是缓慢的，避免冰晶形成；复温应该是快速的。 液体渗透压：正常血浆 280～310 mOsm/kg；
（主要由晶体渗透压构成 胶体渗透压〈1.5 mOsm/kg） 酸碱度： 7.36 ～ 7.44 耐受范围 6.0～8.0；
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三、理化条件 2
细胞之间的相互关系： 1、从组织水平的认识 细胞是结构和功能
干细胞基础与应用基础研究
广西医科大学研究生选修课课程 组胚教研室 陈维平
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干细胞基础与应用基础研究
内容安排 一、理论课 1、细胞体外培养基本技术和方法讨论 2、干细胞的分离与培养 3、胚胎干细胞 4、成体（组织）干细胞 5、讨论交流 二、实验课 1、干细胞的分离、培养与观察 三、考核 内容：设计一份完整的“XX干细胞培养的基本方法（流程）” 时间：2014年1月
一、基本概念
培养基(Nutrient medium)：多指商品，固态或粉剂，未
经溶剂溶解的状态。
培养液(Culture solution medium)：用溶剂溶解后的溶
液，一般添加有血清、抗生素、活性因子等等。
条件培养液(Conditioned medium)：经过某些细胞培养，
含有特定的（已知或未知）细胞分泌物的培养液。
的基本单位，而组织是细胞的存在形式。 2、从细胞水平的认识
a.直接接触型；膜表面分子结合 b.直接联系型；胞间间隙连接 c.间接联系型；生物因子传递
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三、理化条件 3
生长基质（Ground substance）：
大多数机体内的细胞不是生活在液态环 境中的，体外培养环境下表现为贴壁、附 壁生长，培养器皿的表面不适合细胞的这 一特性，必需包被某些物质，以帮助细胞 贴壁、附壁生长。
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二、无机盐
存在形式：离子状态为主 结合（蛋白质或脂
质）
形成与维持培养液的晶体渗透压
对细胞功能活动的支持作用
细胞和组织类型不同，对无机盐的要求也 不同
实验目的不同，对培养基中无机盐的要求 也不同
实验步骤的目的不同，对培养基中无机盐
的要求也不同
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三、理化条件 1
温度：35～37 ℃ 细胞对低温耐受能力强过高温 1、应该对实验有全过程的考虑 2、高温的结果是一样的 3、低温条件下细胞活动减缓至停止 4、对低温的耐受能力与细胞类型、个体年龄等因素有关 5、低温的危害与细胞内外冰晶形成的不均衡有关，故降
连续传代培养
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一、取材 1
取材是整个实验的重要步骤之一，决定 了后续实验步骤的效率。
（一）、实验的目的：
直接影响实验各环节，如培养基的选择、培 养时间的长短等等。
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一、取材 2
（二）、细胞及其所在组织的性质：
帮助确定分离的方法、消化酶的选择与使用等等。
（三）、操作流程的优化：
2、附加成分： 根据实验目的、细胞类型等因素设 定。如B27、N-2，针对神经元；G-5，针对神经胶质 细胞
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（三）基本步骤
取材 ：目的明确、取材准确、避免过多的损失和损伤。 分离: 制作细胞悬液。 纯化： 提高目的细胞富集度。 原代培养：目的细胞在体外条件下的生长、扩增。 传代培养：进一步扩增、纯化。 鉴定：定质、定量。 冻存与复苏：保存
适宜环境 2、应用
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（一）基本概念 2
体内培养(In vivo culture)
方式：移植（Transplantation）
条件：异体相似环境
优点：最大限度模拟自然生长环境
目的：分化研究、临床治疗、特殊
目的（如珍贵细胞株污染的处理）
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（二）基本条件（模拟）
营养条件的模拟
水： 无机盐： 葡萄糖： 维生素： 氨基酸： 细胞因子(Cytokine) ：未知因素
应该充分考虑保持细胞活力：操作时间短、细胞损 失和损伤少。
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一、取材 3
细胞悬液(Cell suspension)：
单个细胞存在于溶液（培养液、平衡液、缓冲液等）。
一般程序：１、解剖 充分暴露、洗涤、剔除多余组
织。
２、分割 1 mm 3植块植块培养
３、分离（散）细胞 机械解离、酶消化、
鳌合剂解离。
４、筛网过滤ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
５、低速离心 500～800 r／m 5～10 min
800～1000 r／m 5～10 min
６、计数、调节细胞密度 10 5个／ml
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二、分离与纯化 1
分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是一个 单一的、独立的步骤，往往贯穿在整个细胞培养 的过程之中。
分离与纯化是衡量细胞培养成功与否的重要标志； 也是建立细胞系（细胞株）的前提。
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2
干细胞基础与应用基础研究 （一）
细胞体外培养 基本技术和策略讨论
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（一）基本概念 1
体外培养 (In vitro culture) 对象：细胞（特定条件下、单一细胞成份）
组织 器官 胚胎（全胚培养 Holo-embryo culture） 条件：体内生存环境的模拟
（天然优化环境～人工环境） 目的：1、建立活体结构成分在体外生存、生长的
1、多聚赖氨酸(Polylysine) 0.05 mg/ml
2、纤维连接蛋白(Fibronectin)
3、胶原 （如 鼠尾胶）
4、层粘连蛋白(Laminin) 5～10μg/ml
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四、培养基的选择 1
参考文献只能提供基本的参考，除重复性实验外，具体 的实验方案应该从多个角度来综合考虑，必要时还应该 做探索性实验。
理化条件的模拟
温度： 液体渗透压： 氧与酸碱度： 细胞之间的相互关系： 培养基的选择
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一、水
细胞及机体内环境～溶解或分散状态离子 和/或分子的水溶液（化学基础）
水的重要性质：
1. 惰性～大多数物质溶于水而不发生化学 反应。
2. 热稳定性和导热性。
3. 表面张力等等：表面张力是维持细胞形 态的重要条件。
1、细胞分离（Separation）：从组织材料、细胞悬 液中获取目的细胞。
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四、培养基的选择 2
二、常用类型
天然培养基：血清、胚胎渗出液、水解蛋白
合成培养基：RPMI1640、Eagle MEM系列（BME、DMEM、IMEM、
αMEM）、HamF12。
无血清培养基：化学成分确定的培养基，对实验目的 和细胞类型的针对性强。
1、基础培养液：DMEM ∶ HamF12 = 1 ∶ 1
（主要由晶体渗透压构成 胶体渗透压〈1.5 mOsm/kg） 酸碱度： 7.36 ～ 7.44 耐受范围 6.0～8.0；
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三、理化条件 2
细胞之间的相互关系： 1、从组织水平的认识 细胞是结构和功能
干细胞基础与应用基础研究
广西医科大学研究生选修课课程 组胚教研室 陈维平
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1
干细胞基础与应用基础研究
内容安排 一、理论课 1、细胞体外培养基本技术和方法讨论 2、干细胞的分离与培养 3、胚胎干细胞 4、成体（组织）干细胞 5、讨论交流 二、实验课 1、干细胞的分离、培养与观察 三、考核 内容：设计一份完整的“XX干细胞培养的基本方法（流程）” 时间：2014年1月
一、基本概念
培养基(Nutrient medium)：多指商品，固态或粉剂，未
经溶剂溶解的状态。
培养液(Culture solution medium)：用溶剂溶解后的溶
液，一般添加有血清、抗生素、活性因子等等。
条件培养液(Conditioned medium)：经过某些细胞培养，
含有特定的（已知或未知）细胞分泌物的培养液。
的基本单位，而组织是细胞的存在形式。 2、从细胞水平的认识
a.直接接触型；膜表面分子结合 b.直接联系型；胞间间隙连接 c.间接联系型；生物因子传递
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三、理化条件 3
生长基质（Ground substance）：
大多数机体内的细胞不是生活在液态环 境中的，体外培养环境下表现为贴壁、附 壁生长，培养器皿的表面不适合细胞的这 一特性，必需包被某些物质，以帮助细胞 贴壁、附壁生长。
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二、无机盐
存在形式：离子状态为主 结合（蛋白质或脂
质）
形成与维持培养液的晶体渗透压
对细胞功能活动的支持作用
细胞和组织类型不同，对无机盐的要求也 不同
实验目的不同，对培养基中无机盐的要求 也不同
实验步骤的目的不同，对培养基中无机盐
的要求也不同
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三、理化条件 1
温度：35～37 ℃ 细胞对低温耐受能力强过高温 1、应该对实验有全过程的考虑 2、高温的结果是一样的 3、低温条件下细胞活动减缓至停止 4、对低温的耐受能力与细胞类型、个体年龄等因素有关 5、低温的危害与细胞内外冰晶形成的不均衡有关，故降
连续传代培养
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一、取材 1
取材是整个实验的重要步骤之一，决定 了后续实验步骤的效率。
（一）、实验的目的：
直接影响实验各环节，如培养基的选择、培 养时间的长短等等。
精品课件
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一、取材 2
（二）、细胞及其所在组织的性质：
帮助确定分离的方法、消化酶的选择与使用等等。
（三）、操作流程的优化：
2、附加成分： 根据实验目的、细胞类型等因素设 定。如B27、N-2，针对神经元；G-5，针对神经胶质 细胞
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（三）基本步骤
取材 ：目的明确、取材准确、避免过多的损失和损伤。 分离: 制作细胞悬液。 纯化： 提高目的细胞富集度。 原代培养：目的细胞在体外条件下的生长、扩增。 传代培养：进一步扩增、纯化。 鉴定：定质、定量。 冻存与复苏：保存
适宜环境 2、应用
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（一）基本概念 2
体内培养(In vivo culture)
方式：移植（Transplantation）
条件：异体相似环境
优点：最大限度模拟自然生长环境
目的：分化研究、临床治疗、特殊
目的（如珍贵细胞株污染的处理）
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（二）基本条件（模拟）
营养条件的模拟
水： 无机盐： 葡萄糖： 维生素： 氨基酸： 细胞因子(Cytokine) ：未知因素
应该充分考虑保持细胞活力：操作时间短、细胞损 失和损伤少。
精品课件
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一、取材 3
细胞悬液(Cell suspension)：
单个细胞存在于溶液（培养液、平衡液、缓冲液等）。
一般程序：１、解剖 充分暴露、洗涤、剔除多余组
织。
２、分割 1 mm 3植块植块培养
３、分离（散）细胞 机械解离、酶消化、
鳌合剂解离。
４、筛网过滤ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
５、低速离心 500～800 r／m 5～10 min
800～1000 r／m 5～10 min
６、计数、调节细胞密度 10 5个／ml
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二、分离与纯化 1
分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是一个 单一的、独立的步骤，往往贯穿在整个细胞培养 的过程之中。
分离与纯化是衡量细胞培养成功与否的重要标志； 也是建立细胞系（细胞株）的前提。
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2
干细胞基础与应用基础研究 （一）
细胞体外培养 基本技术和策略讨论
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（一）基本概念 1
体外培养 (In vitro culture) 对象：细胞（特定条件下、单一细胞成份）
组织 器官 胚胎（全胚培养 Holo-embryo culture） 条件：体内生存环境的模拟
（天然优化环境～人工环境） 目的：1、建立活体结构成分在体外生存、生长的
1、多聚赖氨酸(Polylysine) 0.05 mg/ml
2、纤维连接蛋白(Fibronectin)
3、胶原 （如 鼠尾胶）
4、层粘连蛋白(Laminin) 5～10μg/ml
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四、培养基的选择 1
参考文献只能提供基本的参考，除重复性实验外，具体 的实验方案应该从多个角度来综合考虑，必要时还应该 做探索性实验。
理化条件的模拟
温度： 液体渗透压： 氧与酸碱度： 细胞之间的相互关系： 培养基的选择
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一、水
细胞及机体内环境～溶解或分散状态离子 和/或分子的水溶液（化学基础）
水的重要性质：
1. 惰性～大多数物质溶于水而不发生化学 反应。
2. 热稳定性和导热性。
3. 表面张力等等：表面张力是维持细胞形 态的重要条件。
1、细胞分离（Separation）：从组织材料、细胞悬 液中获取目的细胞。
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四、培养基的选择 2
二、常用类型
天然培养基：血清、胚胎渗出液、水解蛋白
合成培养基：RPMI1640、Eagle MEM系列（BME、DMEM、IMEM、
αMEM）、HamF12。
无血清培养基：化学成分确定的培养基，对实验目的 和细胞类型的针对性强。
1、基础培养液：DMEM ∶ HamF12 = 1 ∶ 1