染色体核型分析

染色体核型分析
染色体标本制备及核型分析 质量保障部 Faye
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一、名词解释
二、染色体标本制备
实验耗材 前期处理 实验步骤
三、染色体核型分析
玻片标本质量评价 计数标准、合格指标 染色体核型排列 核型检测的可重复性
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பைடு நூலகம்
一、名词解释
核型
一个体细胞中的全部染色体，按其大小、形态特征 顺序排列所构成的图像。
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二、染色体标本制备
实验内容
细胞收获
低渗处理
预固定
固定
制片
用滴管吸取细胞悬液，高空滴在冰冻玻片上，立即在 酒精灯的火焰下过火几次，置80℃烤箱中烤片2h。
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定
要求：洁净、冰冻 处理：逐片清洗（洗洁精→ 超声波→自来水→纯水）， 95%乙醇浸泡24 h，纯水逐片 刷洗，放置于装有纯水的器
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定
配制：甲醇：冰乙酸= 3：1， 现用现配。
作用：固定并维持染色体结 构的完整性
防护：甲醇→毒性， 冰乙酸→刺激性和腐蚀性
制片
离心弃上清，将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔 地重悬细胞。沿管壁缓慢加入固定液0.5-1.0 mL，边 滴加边震荡均匀，静置5 min后离心弃上清。
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定 制片
要求：0.25%， pH6.8～7.2
作用：去除染色 体上的蛋白质，
便于染色。
配制： Giemsa原 液：磷酸缓冲液 （pH 7.4）= 1：9，
现用现配。
预热胰蛋白酶消化25-30s，Giemsa染色10min。 清水冲洗染液，用吹风机吹干。
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三、染色体核型分析
实验耗材
仪器设备： 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、光学 显微镜、刻度离心管、乳头吸管、棕色试剂瓶、载玻片、 吹风机、玻片架、染色缸
主要试剂： 秋水仙素、低渗液、卡诺氏固定液、吉姆萨染液、胰酶、 1N HCl、1N NaOH、MEF培养基、PBS
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二、染色体标本制备
前期处理
样品要求：对数期生长， 状态良好，紧密度高，折 光性好，细胞量≥T25 / 60 mm平皿 差速贴壁法去除MEF （ KSR培养体系除外） 终止培养前1~2小时，加入秋水仙素（100ug/ml）， 最终浓度为0.1~0.2ug/ml。
染色体形态适中，不过度短小或纤长，染色体彼此间 无交联缠绕或者交联的染色体能明确的区分。
染色体G显带普遍较清晰，质检人员能够精确的判断核 型位置。
合格指标
计数30个分裂相，正常比例≥50% →数量是否异常 暂不涉及核型排列 →结构是否异常
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三、染色体核型分析
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获
低渗处理
预固定
固定
制片
（1）加入3ml固定液，静置30min，离心弃上清； （2）再次加入3ml固定液，吹打均匀并静置30min
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获
低渗处理
预固定
固定
制片
离心弃上清液，根据细胞数量情况，加入1~2 mL固定 液，吹打细胞制成悬液，悬液呈微白色时为最佳。
加入37℃预热的低渗液（0.075 mol/L）5 ml，吹 打至均匀，37℃水浴15-20 min。
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获
低渗处理
预固定
固定
制片
离心弃上清，将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔 地重悬细胞。沿管壁缓慢加入固定液0.5-1.0 mL，边 滴加边震荡均匀，静置5 min后离心弃上清。
作用：破坏纺锤体 防护：有剧毒、无挥发性 整理因ppt素：时间、浓度
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定 制片
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定 制片
消化并收集细胞至离心管，吹打成单细胞悬液， 250 g，5 min离心，弃上清
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玻片标本质量评价
玻片颜色
蓝紫色
玫红色
着色浅
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配制新的染液； 适当提高胰酶消化玻片的时间。
三、染色体核型分析
玻片标本质量评价
细胞密度
过密
适中
过稀
制备玻片时，对每一个样品都先进行试片，并在镜下观 察细胞密度，从而调整悬液密度。
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三、染色体核型分析
玻片标本质量评价
分裂相密度
足够
稀少
适当提高固定液中冰醋酸比例；制备较多的玻片
小鼠：♂ 40，XY 、♀ 40，XX 人类：♂ 46，XY 、♀ 46，XX
分裂相
细胞分裂过程中每个时期的细胞形态特征，包括细胞的 总体形状和遗传物质的变化。
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一、名词解释
（中期）分裂相
核型
数量变异
（性染色体丢失/增加、近端着丝粒染色体三体）
结构变异
（缺失、重复、倒位、易位）
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二、染色体标本制备
二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定 制片
加入37℃预热的低渗液（0.075 mol/L）5 ml，吹 打至均匀，37℃水浴15-20 min。
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定 制片
配制： 0.075 mol/L KCl溶液 作用：低渗作用
因素：时间、温度、浓度
皿中，4 ℃保存。
制片
用滴管吸取细胞悬液，高空滴在冰冻玻片上，立即在 酒精灯的火焰下过火几次，置80℃烤箱中烤片2h。
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二、染色体标本制备
实验步骤
细胞收获 低渗处理 预固定
固定 制片
预热胰蛋白酶消化25-30s，Giemsa染色10min。 清水冲洗染液，用吹风机吹干。
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二、染色体标本制备
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三、染色体核型分析
玻片标本质量评价
分裂相形态
重叠
尽量将细胞吹打成单细胞悬液； 滴片时勿重复滴加同一区域。
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三、染色体核型分析
玻片标本质量评价
染色体形态
适中
短小
过长
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扭曲交联 消化过度
三、染色体核型分析
计数标准
分裂相需完整独立，染色体不过于松散，周围无其他 距离很近的分裂相。
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三、染色体核型分析
玻片标本质量评价
分裂相形态-紧密度
过密
适中
过密：适当提高固定液中冰醋酸比例； 过散：适当降低固定液中冰醋酸比例。
过散
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三、染色体核型分析
玻片标本质量评价
分裂相形态
过密
适中
过散
过密：适当提高固定液中冰醋酸比例，增加滴片高度； 过散：适当降低固定液中冰醋酸比例，减小滴片高度。