人胰岛素的酵母表达与纯化

人胰岛素的酵母表达与纯化

1.项目意义

作为治疗糖尿病的主要药物，胰岛素用于临床已有70多年，是临床上用量最大的蛋白质类药物，重组DNA技术出现，胰岛素是最表达的哺乳动物蛋白之一。旨在改善现有商品。胰岛素治疗学性能的研究，是胰岛素是胰岛素蛋白工程的主要内容。现已知现已知各种胰岛素类物愈300多种，但具有临床前景的不多。在天然突变胰岛素原有的基础上曾用化合方法合成人工人胰岛素，发现其活力高于天然胰岛素。这也是通过改变氨基酸残基获得的高活力胰岛素，但有关重组胰岛素对其对其性质研究不够系统。可以先利用猪腰素前体在酵母中分泌表达，表达产物的分离纯化，进而由纯化的表达产物通过酶促转酞获得人胰岛素以及人胰岛素的酵母蛋白。

2.相关研究进展

酵母菌与人类的关系源远流长，早在八千年，人们就用酵母菌来制作面包、酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。到20世纪末酵母菌以作为一种模式生物在生物化学、遗传学和分子生物学研究等方面担任了重要的角色。自从1978年建立酵母菌遗传转化技术以来，酵母菌已成为生产异源蛋白及其生物学分析方面最有用的真核微生物。酵母菌的生物学研究取得了巨大的进展，1996年完成了酵母菌全基因组的序列测定，已建立了相关基因库，如啤酒酵母基因库，酵母蛋白组数据库，这些数据库容纳了有关酵母菌的6000多个基因及其蛋白质功能、结构和相互间的关系等大量信息。现在已有不少用于食品和酿造工业的遗传修饰酵母工程菌问世。

早期关于胰岛素的研究是从猪、牛、羊的胰腺中提取的相关产品，直到1936年才利用重结晶法再锌离子的存在下得到了纯化的胰岛素结晶，而胰岛素纯化的真正历史性突破是1960年色谱技术出现以后，使纯度的单一胰岛素分子制成为可能。1965年我国科学家首次完成了牛结晶的合成胰岛素，20世纪70年代丹麦首次产出半合成胰岛素。1982年美国首先利用重组DNA技术合成了人胰岛素，标志着生物工程胰岛素产品时代开始。1996年美国通过胰岛素化学结构进行了改造和修饰有开发出了第一个胰岛素类似物。目前有300多个胰岛素类似物已在实验室制备出来。

3.研究内容

胰岛素在酵母中的表达

1.提取人胰岛素基因

2.利用PCR增值人胰岛素基因

3.人胰岛素的克隆与表达载体的构建

4.人胰岛素在酵母菌中的诱导表达

5.检测胰岛素的表达

6.裂解表达后的酵母菌

7.分离提取单蛋白

8.纯化蛋白