基因沉默

基因沉默
摘要随着基因技术的迅速发展和广泛应用，在转基因技术实践中首先暴露出来的外源基因不能按照预期设想进行表达的问题越来越显得普遍，而人们对基因沉默现象的不断深入研究和探索，不仅揭示出了基因沉默的发生机制，也在一定程度上推动了新技术的产生和应用，这不仅推动了基因研究领域的发展，更在遗传群体构建、疾病治疗等方面建立了新方法、新体系，为生物学技术的发展做出了贡献。

关键字基因沉默分类机理应用
1.引言
基因沉默（Gene Silencing），又称为基因沉寂，是真核生物细胞基因表达调节过程中的一种特殊生理现象，是指细胞基因在表达过程中受到各种因素的综合作用而导致基因部分区段发生“沉寂”现象，从而失去转录活性并不予表达或表达减少。

该现象最先于1986年Peerbolte在转基因植物研究中所发现，随后科学家在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现了基因沉默现象的存在。

转基因沉默是基因沉默现象最为频发和常见的，这也是转基因为何在受体难以百分之百全部表达的因素之一，其基本特征是导入并整合到受体基因组的外源基因在当代或后代中表达活性受到抑制。

研究发现，其主要原因是由于转基因之间或转基因与内源基因之间存在着序列同源性，因此转基因沉默又被称为同源性依赖的基因沉默（homology-dependent gene silencing）。

根据沃森-克里克的核酸碱基互补配对模型，基因沉默可能涉及到DNA-DNA、DNA-RNA以及RNA-RNA三种不同形式的核酸分子之间的互作，简单地说就是插入的外源DNA或自身基因区段在核内高浓度的RNA作用下，能够与内源反向DNA 或者RNA进行碱基互补配对，并且在核内被重新甲基化，进而导致基因沉默；而另一种可能则是内源基因与转基因转录生成的RNA之间互补配对生成可被RNases酶性降解的双链RNA（dsRNA），其水解直接导致基因的不表达，即基因沉默效果。

从染色体水平上看，基因沉默现象的实质是形成异染色质（Heterochromation）的过程，检查发现被沉寂的基因区段往往呈现出高浓缩状态，显然，这在一定程度上也决定了被沉寂基因的难表达性。

实验早已证明，在高度浓缩的基因区段，正常的DNA转录活动是难以进行并维持的，换言之，即一旦形成异染色质进入高度浓缩状态，那么相应区段的基因片段就必然因为不能被
转录而表现无活性。

然而看似简单的这一点变化，其中的分子机理却错综复杂，有些至今依旧是生物学研究中难以解答的。

事实上，由于现代转基因技术以及遗传学研究领域的飞速发展和扩张，以此为代表的基因表达高效性和特殊遗传样本的构建，基因沉默的现象及生理学意义正逐渐成为基因技术的前沿，乃至分子遗传学研究的热点。

基于此，了解和掌握相应的基因沉默机制对于每一个生物科学研究者而言都具有显而易见的优势，尤其是在转基因以及遗传学领域。

2.基因沉默的分类
根据现有实验或理论表明，基因的沉默多发生在转录水平和转录后水平，据此，部分文献将基因沉默分为两类，即转录水平的基因沉默（transcription gene silencing, TGS）以及转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。

然而有些基因沉默类型显然是难以服从上述两种分类的，例如转基因沉默中的位置效应（position effect），其沉默机制简言之可以表述为转基因导入位点处于异染色质状态或外源基因与受体基因区段存在显著差异进而被细胞防御免疫系统所识别并消除，这两种情况都是发生在转录前的染色体DNA自身的变异或效应，并不具备转录水平基因沉默定义中在转录水平上发生沉寂的条件。

因此，基因沉默又可以划分为三类，除了上述两种外，还有染色体DNA水平的基因沉默。

在现有实验技术手段下，可以利用DNA免疫印迹（Northern blotting）、RNA酶保护分析（RNase protection assay）和细胞核进行转录分析（Nuclear run-on assay）对上述基因沉默层次加以区分和判断。

不过鉴于基因沉默现象用于人工操纵这一事实，基因沉默又可以根据沉默的发生是否处在人为控制或操纵之下，可以简单划分为被动基因沉默和主动基因沉默。

根据这一划分原则，目前所知的任意沉默机制均可包含其中，例如转基因技术中目的基因常由于内源性因子的干扰而不能按预期设想进行相应表达的现象归入前者，但诸如RNA干扰技术（RNAi）、基因敲除等人工干预手段导致的基因沉默则应划归为后者，即主动基因沉默。

2.1被动基因沉默
在基因沉默研究最为深刻的转基因领域，在实验中常常会发生导入的目的基因在受体细胞中不能够按照实验预期进行表达，亦或是表达减少的情况，研究上可以将这种受受体细胞内源性因子影响而导致的基因沉默称为被动沉默。

实验表明，转基因沉默发生的层次水平具有多样性和特殊性，不过总结起来可以划分为染色体DNA、转录和转录后三种不同的层次。

在已知的理论或实验依据下，染色体DNA水平的基因沉默包含位置效应、DNA甲基修饰以及组蛋白乙酰化；在转录
水平上，基因沉默的可能类型包含基因启动子甲基化、同源基因反义失活、后成
修饰作用（epigenetic effect）以及多拷贝重复序列等；而转录后水平的基因沉默，则分为基因共抑制（co-suppression）以及基因压制。

除此之外，由生物
自我保护机制引发的基因沉默也属于被动基因沉默范畴。

2.1.1染色体DNA水平
外源基因所整合到的目的基因组的特性将直接决定外源基因的表达情况，这种效应称之为位置效应。

位置效应大体上可由两种情况所引发，一是目的基因整合位点或基因区段处于受体基因组中高度甲基化或异染色质化的异染色质区和重复序列区，由于这些基因区段的特殊性和高度不可表达性，由此外源基因在整合到相应区段时就不可避免地陷入沉默。

事实上，这种情况下的转基因仍是完整和可表达的，只限于所整合位点的特殊性而丧失表达的可能。

二是外源转基因在碱基组成上和整合区段有着显著的差异，进而被受体细胞的防御免疫系统所识别并做出相应反应，由此该区段被限制表达或不表达。

不过细胞防御系统究竟是如何做出反应并对相应区段限制表达的机理现在并无确凿证据说明，结合X染色体随机失活现象和基因组印记研究，酶性识别或是失活中心假说均可以在一定程度上解释并预测某些现象，但实验上还没有给出相关研究说明。

DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化是基因沉默在染色体DNA水平上的另一种机制。

很早以前研究就已经证明了DNA甲基化参与了染色质凝聚状态的形成，事实上，这也是最早发现的基因修饰途径之一，几乎存在于所有高等生物的基因表达调控中。

其主要作用机理是通过甲基化来改变位点DNA的构象，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。

至于组蛋白乙酰化的分子机制也大体类似，即组蛋白在完成翻译后，其氨基末端常发生包括乙酰化在内的多种共价修饰，并最终相互联合或依次被特定蛋白酶或其它复合体所识别、结合，为激活或抑制相应基因转录的染色质相关蛋白提供结合位点。

2.1.2转录水平
启动子甲基化是转录水平上的基因沉默中较为常见的一种，比之于上述的DNA甲基化实质上并没有区别，只是发生的区段和在基因表达的先后时间顺序上有所差异。

研究发现，转录水平上的甲基化多发生在基因5，端的启动子区域，基因的表达水平与其整合位点的甲基化程度密切相关，而这种甲基化的发生条件则依赖于一种被称之为从头甲基化转移酶（de novo DNA methytransferase, DNMT）的识别和加工。

这种基因区段性的甲基化是通过核酸碱基互补配对实现传递的，现有实验证明这种甲基化是可以由基因5，端的启动子区域延伸到基因3，端，而核苷酸配对过程得以使甲基化在基因组中自由传递，进而导致整合区域的基因均不表达或随机表达，这与基因转座子相类似，去甲基化试剂可以逆转转基因沉寂现象即可说明这一理论。

而同源基因间的反式失活是近年来新发现的一种基因沉默机制，是一种由于
拥有同源序列的沉默位点和其他位点的DNA的互作而引起的基因沉默。

其作用原理是通过顺式作用甲基化失活的基因作为一种“沉默子”，并对其他与之分离且具有同源性的靶基因施加反式作用使之甲基化失活，从而达到沉默基因的目的。

后成修饰作用是一类比较特殊的基因沉默，与其他类型不同的在于后成修饰作用并不改变基因的序列或碱基组成，基因沉默的方式表现在细胞内因子对功能的即时关闭和解除的控制上。

显然，这种转基因沉默与受体植物的核型构成有关。

此外，外源基因如果通过PCR技术扩增并以多拷贝的形式整合到受体基因组DNA 的同一位点上，则导入的基因会发生自身重复序列间的相互配对，形成可被甲基化酶特异性识别的结构，进而发生甲基化作用，抑制基因的表达，由此转录失活，这种的基因沉默称为重复序列间基因沉默，其作用机理可能与异染色质化相关蛋白质结合体的识别配对序列结构有关。

但有研究认为，重复序列很可能是通过一位配对，即多拷贝重复基因序列之间以及外源基因与转录产物之间的配对，使整整合位点的染色质发生异染色质化或DNA的甲基化，在空间上形成位阻，进而阻碍了转录因子与外源基因的接触，这与实验相吻合，也是大多数研究者所共同持
有的观点。

2.1.3转录后水平
转录后水平的基因沉默是指基因在细胞核里能够稳定转录，但在细胞质里却无相应的稳定mRNA存在的现象，简言之即转录后沉默发生在细胞质中，转录产物能在细胞核中积累但在细胞质mRNA被迅速降解或不能正常被加工。

在植物基因研究中上述现象称为共抑制，但事实上，共抑制是最常见的转录后水平基因沉默，该现象最先由Napoli在CHS基因的矮牵牛花中发现，并普遍存在于转基因植物中。

与TGS相比，PTGS显得更为普遍和常见。

转录后水平的基因沉默是指导入的外源基因引起内源基因或外源与内源基因两者共同的沉默，本质上是由基因转录本（转录本：由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟mRNA）过量引起的。

由反转录酶—聚合酶连锁反应（Reverse Transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）实验，在出现共抑制现象的转基因受体细胞中积累着高浓度的正常mRNA，但细胞质中却几乎检测不到mRNA，由此说明这类基因沉默不是发生在转录水平，而是属于转录后的调控过程。

而在真菌领域，上述基因沉默则被称为基因压制（quelling），并由Cogoni 等人最先在粗糙链孢霉的转化实验中所发现，其特征是外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达。

作为转录后水平的基因沉默，该发现有力的证据是在实验中发现已获得的稳定态mRNA的大量减少。

相较于转基因植物中的共抑制，亦或是真菌中的基因压制，在动物中这类基因沉默则以RNA干扰（RNA interference，RNAi）的形式出现，但三者在本质上具有极大的相似性和可比较性，事实上，后
者正作为遗传学研究中的一种常规基因操纵手段，在遗传材料制备和遗传信息改良等方面正发挥着
基于以上的若干事实，人们提出了许多假设和模型试图来解释和验证共抑制现象存在的分子机理，但无论是RNA阈值模型（Dougherty和Park，1995）、异常RNA模型（Jorgensen等，1998）、RNA介导的病毒抗性模型（Mueller、Lindbo 等，1993）还是现在较为学术界所接受和认同的反义RNA模型（Lee等，1997），也只是能够在一定程度上部分解释了实验中的共抑制现象，并无法圆满阐述清楚这一基因沉默现象的本质。

2.1.4生物自我保护机制
相对于受体细胞的完整基因组而言，导入的经人工修饰的外源基因无疑使具有相当显著外来特征的入侵者。

实验证明转导的外源基因在受体中很容易被受体基因组中存在的重组和修复系统所识别，进而引发不同程度的排斥反应，以自我保护基因组的独立和完整性。

在受体的自发性基因保护中，导入的外源基因将有极大的可能性在基因自发修复下发生重组，而且这样的外源基因重组是随机的，由其导致的转基因结构异常也将可能致其失活，并最终表现为基因的沉默。

2.2主动基因沉默
在现代分子生物学研究中，无论是转基因还是分子遗传学，都不可避免地需要构建特殊的、非天然的人工实验材料，因此，研究者为了能够获取所能够满足实验要求的样本，常常会有目的地对实验材料进行基因干预改造，并迫使其中部分基因不予表达或激活表达。

在这种条件下发生的基因沉默由于是由于人的主观意愿，因而划归为主动基因沉默。

事实上，目前研究上使用的主动式基因沉默手段多为RNA干扰技术，在分子水平上并没有改变基因序列本身，而是部分属于转录后水平基因沉默范畴，但在另一类主动基因沉默中，基因敲除作为基因沉默中最为激烈的手段，在相关研究领域也拥有着许多重要应用。

在主动基因沉默技术中，RNAi是一种较为常用的转录后水平的基因阻断技术。

其作用机理可简述成通过人为导入与靶基因具有同源性的双链RNA（dsRNA），在dsRNA特异性核酸内切酶（dsRNA specific endonuclease, Dicer）的作用下将dsRNA断裂形成若干个干扰性小RNA（small interfering RNA, siRNA），而后siRNA中的反义链指导合成具有靶向介导能力的RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex, RISC），RISC再切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，并最终通过酶性降解达到干扰基因表达的作用。

基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的基因打靶技术，是指从分子水平上将一个基因去除或代替，通过改变DNA序列达到基因功能缺失的表象。

基因敲除技术主要包含下列技术：构建重组载体，重组
DNA转入受体细胞核内，中靶阳性细胞的筛选以及转基因动物。

作为性状消失的极端手段，对于遗传基因功能研究和性状判定具有不可替代的作用。

但鉴于基因敲除具有的低成功率前提，故在实践操作上也具有繁琐和高花费的缺点。

3.总结
基因沉默，尤其是主动基因沉默现象及其原理的发现，给现代转基因技术和遗传研究带来了巨大的进步空间，而如何有效得在受体转基因研究和遗传群体构建中应用相应的主动基因沉默技术则是一个极具价值的科研热点。

在上述中可知，RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来的迅速发展使之很快成为功能基因组、转基因和遗传研究的有力工具。

通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源基因的表达，从反向遗传的角度研究基因组中未知的基因功能，并在转基因研究中加以有效利用，将极大消除转基因的被动沉默可能。

再者，RNAi技术与传统的基因敲除技术相比，其特异性更高，作用也更为迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对受体细胞本身的调控系统却影响不大。

在遗传群体构建研究中，已经可以利用RNAi技术对植株定向遗传改造从而得到能够稳定遗传的有利性状实验已经得到了初步成果，对水稻低蛋白质含量试验和拟南芥稳定性状遗传研究的成功即是新技术应用的成果。

基因的沉默是基因表达调控的一种重要的方式，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制，在外源DNA侵入、病毒侵染和转基因等外源实验中具有相当的普遍性。

对基因沉默进行深入研究，可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质，在基因克服沉默现象，从而使外源基因能够更好的按照人们的需要进行有效表达；利用基因沉默在基因改造中有效抑制有害基因的表达，达到获取有利遗传特征的目的，所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义。

而在研究基因沉默现象时产生的新技术、新方法，不仅推动了遗传学本领域研究的发展，更是对生物学相关研究领域做出着巨大的贡献，由此产生和带动的经济和科研价值将不可估计。

RNAi技术的诞生与应用，不仅能大大推动蛋白质工程的发展，还将可能在未来设计出具有高度特异性地RNAi芯片，通过高通量地筛选药物靶基因，逐条检测基因组的表达抑制情况来明确基因的具体功能。

而利用RNAi技术靶向抑制基因的表达，则为改良作物遗传特征开辟了新途径。

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