BD人间充质干细胞表面标记检测试剂盒说明书
人间充质干细胞表面标记分子的研究进展
【 Ｋｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ 】 Ｍ ｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍ ａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ； Ｓ ｕ ｆ ｒ ａ ｃ ｅ ｍ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ ； Ｓ ｔ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ
干 细 胞 根 据 所 处 的 发 育 阶 段 可 分 为 胚 胎 干 细 胞 和 成 体 干 细胞 ， 间充 质 干细胞 （ ＭＳ Ｃ ） 是 成 体 干 细 胞 家 族 的 重 要 成
Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： ＸＩ Ａ ０ Ｒａ ｎ 一 ｍａ ｉ ｌ ． ＂ ｘ ｉ ａ ｏ ｒ ｎ ＠ｐ ａ ｕ ｍｃ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎＩ
人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究
人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【摘要】目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法.方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红0染色鉴定.实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pcDNA3.1 (+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs 加入10％ FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表达量.结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA 表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义.结论:转染EGF的HaCat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持.【期刊名称】《中国美容医学》【年(卷),期】2014(023)022【总页数】5页(P1899-1903)【关键词】脂肪间充质干细胞;HaCat细胞;表皮细胞;组织工程【作者】赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【作者单位】解放军第211医院五官科黑龙江哈尔滨150080;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R751;R64皮肤缺损是外科领域的常见问题，尽早封闭创面，减少机体消耗和内环境紊乱是治疗皮肤缺损的关键。
BD-CBA 操作说明书
试剂提供：磁珠试剂1、Human inflammatory cytokines capture beads (A1-A6) : 0.8ml/管，6管抗体包被的磁珠时间长了会有沉淀，用前斡旋3-5秒2、Cytometer Setup Beads (D): 1.5ml校正起始仪器PMT电压和补偿参数设置。
每次使用50ul.抗体及标准试剂1、Human Inflammatory Cytokines PE Detection Reagent (B): 4mlPE包被的人6种炎症因子抗体，每次试验用50ul.2、Human Inflammatory Cytokines Standards (C)：2个瓶，0.2ml的冻干粉/瓶两个瓶，包含了冻干的人重组蛋白，每个瓶用2ml Assay Diluent稀释准备母液标准品。
重悬之后，在2-8℃稳定，12小时内使用。
3、PE Positive Control Detector（E1）：1瓶，0.5ml每次使用50ul, 用于Cytometer Setup Beads来设置最初仪器补偿参数。
4、FITC Positive Control Detector（E1）：1瓶，0.5ml每次使用50ul, 用于Cytometer Setup Beads来设置最初仪器补偿参数。
缓冲液Buffer试剂1、Wash Buffer (F)：260ml, PBS(1×)用于洗涤及重悬洗涤过的磁珠2、Assay Diluent (G): 30ml/瓶用于重组和稀释人炎症因子标准品以及稀释测试样本3、Serum Enhancement Buffer (H): 10ml当检测血清或血浆标本时，用于稀释混合后的捕获磁珠（Capture Beads）准备人炎症因子标准品：1、打开一瓶冻干粉的炎症因子标准品，转移标准品白色微球到一个15ml的聚丙烯管中，标记上“母液”。
2、加入2ml Assay Diluent (G)溶解重建。
临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范
DB32/T3544-2019临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范1范围本标准规定了临床级人体组织来源间充质干细胞制备的基本要求、操作规范和质量控制。
本标准适用于临床级人体组织来源间充质干细胞的样本采集、制备、冻存、复苏与质量控制。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB3095环境空气质量标准GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB50073-2001洁净厂房设计规范GB50346实验室建筑技术规范GB50591洁净室施工及验收规范WHO实验室生物安全手册（第三版）药品生产质量管理规范（卫生部令第79号）中华人民共和国药典（2015年版）干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)（国卫办科教发﹝2015〕46号）T11/CSSCR001-2017干细胞通用要求（中国细胞生物学学会-干细胞生物学分会团体标准）3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1临床级人间充质干细胞clinical grade human mesenchymal stem cells符合质量要求，可用于临床研究和应用的人多种组织来源（脐带血、脐带、胎盘、子宫内膜、脂肪、牙齿、骨髓等组织）间充质干细胞。
3.2伦理审查委员会ethical review committee负责对科学研究中涉及的伦理道德问题进行评估和审查的专门组织。
3.3科学审查委员会scientific review committeeDB32/T3544-2019负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查的专门组织。
3.4生物安全委员会institutional biosafety committee负责制定生物安全政策和安全操作规范的专门组织。
3.5知情同意informed consent具有完全民事行为能力的自然人在重复获取信息并准确理解其内容后，作出接受或不接受样本采集的决定，此决定不受恐吓、利诱或其他不当行为的影响。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
BD破膜剂试剂手册中文
破膜剂试剂手册BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒手册（目录号554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注册商标。
Hypaque是Amersham Health AS的注册商标。
BD流式细胞仪是1流激光产品。
仅供研究使用。
不用于诊断或治疗程序。
2016年Becton，Dickinson 和公司。
版权所有。
本出版物的任何部分不得以电子，机械，磁性，光学，化学，手册或其他方式以任何形式或通过任何方式复制，传播，转录，存储在检索系统中或翻译成任何语言或计算机语言，未经BD Biosciences事先书面许可。
购买不包括或携带任何权利转售或转让本产品作为独立产品或另一产品的组成部分。
未经Becton，Dickinson和Company明确书面许可，严禁使用本产品以外的许可使用。
2016BD，BD徽标和所有其他商标均为Becton，Dickinson和Company的产权。
目录BD Cytofix / Cytoperm固定/渗透试剂盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂）警告和注意事项1.一般程序A.刺激细胞1.使用BD GolgiStop的程序蛋白质转运抑制剂（含有莫能菌素）2。
使用BD GolgiPlug 蛋白质转运抑制剂的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1收集细胞2.阻止Fc受体3.细胞表面抗原染色4.固定和渗透细胞5.备选固定和渗透方案6细胞内细胞因子染色C.流式细胞分析。
间充质干细胞的表面标记物
间充质⼲细胞的表⾯标记物间充质⼲细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是⼀类存在于多种组织(如⾻髓、脐带⾎和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等），具有多向分化潜⼒的成体⼲细胞。
它可以向多种间充质系列细胞（如成⾻、成软⾻及成脂肪细胞等）或⾮间充质系列细胞分化。
间充质⼲细胞具有低免疫原性，⼀般都不会引起宿主的免疫反应。
这种特性使其在⾃⾝免疫性疾病以及各种替代治疗等⽅⾯具有⼴阔的临床应⽤前景。
1. 间充质⼲细胞来源与分布2. 间充质⼲细胞的定义3. 间充质⼲细胞⽣物学特性4. 间充质⼲细胞的免疫调节作⽤5. 间充质⼲细胞的细胞表⾯标记物6. 间充质⼲细胞的应⽤1. 间充质⼲细胞来源与分布间充质⼲细胞是1987年由Friedenstein等⼈[1]利⽤⾃然贴壁法从获得的⾻髓基质细胞中发现的。
间充质⼲细胞（MSCs）的概念最早在1991年由Caplan提出。
MSCs这⼀类群细胞的异质性⽐较⼤，故⽆法定MSCs的发育起源。
⽐如⽛髓、⽪肤等属于外胚层来源，⾻髓、脂肪组织、围产期组织等则属于中胚层来源。
间充质⼲细胞⼴泛存在于⼈体各组织中，可来源于⾻髓，胰腺，⽪肤肺等多处器官组织。
也在许多其他的组织中发现有间充质⼲细胞的存在，在滑膜、肝脏、肺脏、⽛周质、胰腺、眼结膜、脂肪、肌腱、甚⾄在⽺⽔及头⽪组织中均可以培养出间充质⼲细胞。
图1 间充质⼲细胞的来源2. 间充质⼲细胞的定义⾃1991年MSCs的概念提出之后，在接下来的⼗年内报告MSCs的组织类型激增。
这就需要对MSCs的定义有⼀个明确的标准。
2006年，国际细胞疗法协会（ISCT）制定了MSCs的定义的基本标准，也是MSC最低的鉴定标准：•在标准体外培养条件下呈贴壁⽣长状态。
•⼤于或等于95%的细胞表达CD105、CD73和CD90，且表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-Ⅱ类分⼦的细胞不应超过总数的2%[2]•在体外诱导条件下，具有分化为成⾻细胞、软⾻细胞及脂肪细胞的能⼒。
人骨髓间充质干细胞免疫表型
人骨髓间充质干细胞免疫表型
人骨髓间充质干细胞是一类来源于骨髓的多能干细胞，具有广泛的多向分化能力和免疫调节功能。
免疫表型是指干细胞在表面表达的免疫相关标记物。
BM-MSCs通常被认为具有低免疫原性和免疫调节特性，能够抑制炎症反应并调节免疫应答。
以下是一些常见的人骨髓间充质干细胞的免疫表型标记物：
1. 表面标记物CD73（5'-核苷酸酶）和CD105（内皮细胞特异性抗原1）：它们是BM-MSCs的特异标记物，用于鉴定和区分BM-MSCs。
2. 克隆标记物CD90（Thy-1）：它是一种早期表型和干细胞特异性标记物，常用于标记BM-MSCs。
3. 免疫抑制相关标记物CD44（提供细胞-细胞相互作用）、CD29（β1整合素）和CD166（启动细胞化学）、HLA-ABC（人类白细胞抗原A、B和C）等。
4. 免疫抑制相关分子HLA-G（人类白细胞抗原G）：它是一种非经典的类I型MHC分子，在免疫耐受和抗炎反应中起到重要作用。
需要注意的是，BM-MSCs的免疫表型标记物可能因不同来源、培养条件和实验方法的不同而有所差异。
因此，在研究和应用BM-MSCs时，需要结合多个标记物来评估其特性和免疫功能。
骨髓间充质干细胞的免疫表型及其调节免疫应答的能力使其在免疫治疗和组织工程等领域具有广泛的应用前景。
人脂肪间充质干细胞系说明书
气相：空气，95%；二氧化碳，5%温度：37℃
冻存液
人间充质干细胞培养液80%，FBS10%，DMSO 10%
细胞说明
正常的人脂肪间充质干细胞，具备分化成脂肪、成骨和软骨的能力。CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表达阳性；CD14、CD31、CD34、CD45表达阴性。
细胞总数/每支
106
体积/每支
500µl
传代方法
0.05%Trypsin-EDTA消化后按1:2—1:3比例或5000个细胞/cm2进行传代，待CSP number
SCSP-404
细胞名称
人脂肪间充质干细胞系
英文名称
Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells
细胞描述
脂肪来源，间充质干细胞
物种
人，女性
细胞来源
ATCC
ATCC货号
PCS-500-011
培养液配方
（1）间充质干细胞基础培养基485 ml (ATCC货号PCS-500-030)（2）间充质干细胞生长试剂盒一个(ATCC货号PCS-500-040）
BD破膜剂试剂手册中文
BD流式细胞仪是1流激光产品。仅供研究使用。不用于诊断或治疗程序。2016年Becton，Dickinson和公司。版权所有。本出版物的任何部分不得以电子，机械，磁性，光学，化学，手册或其他方式以任何形式或通过任何方式复制，传播，转录，存储在检索系统中或翻译成任何语言或计算机语言，未经BD Biosciences事先书面许可。购买不包括或携带任何权利转售或转让本产品作为独立产品或另一产品的组成部分。未经Becton，Dickinson和Company明确书面许可，严禁使用本产品以外的许可使用。2016BD，BD徽标和所有其他商标均为Becton，Dickinson和Company的产权。
注2：BD Perm / Wash缓冲液作为包含FBS *的10 *储备溶液。该产品的颜色可能因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。
BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）
C.流式细胞分析。
D.染色控制
1.阳性染色控制
2.阴性染色控制
a.同种型对照
b.配体阻断控制。
c.未标记的抗体阻断控制。
解决方案
样品数据
备选方案
全血活化和细胞内染色。
预期结果
解决方案
参考文献
BD Biosciences提供三个试剂盒，以简化细胞的固定和透化，用于细胞质内细胞因子的免疫荧光染色。BD Cytofix / Cytoperm固定/渗透试剂盒提供固定/透化溶液和渗透/洗涤溶液。BD Cytofix / Cytoperm Plus Fixation / Permeabilization Kit（含有BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）提供了这两种溶液加上含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂，用于处理新鲜移植或培养的细胞，以促进胞质内细胞因子的积累。BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含有BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂）提供了两种溶液，另外还有一种含有布非司定A的蛋白质转运抑制剂。这些试剂盒提供足够的两种染色≥200个细胞样品的溶液。
人间充质干细胞培养试剂盒说明书
人间充质干细胞培养试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人间充质干细胞培养试剂盒【产品型号】A型、B型【包装规格】500mL/kit【预期用途】仅用于对人间充质干细胞的增殖培养，不具备对细胞的选择、诱导、分化功能。
培养后的细胞用于体外诊断。
【检验原理】细胞培养广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一，建立合适的细胞培养方案能够有效提高实验效率和实验稳定性，同时节约实验成本。
在传统细胞培养过程中，培养基中大多含有FBS或FCS，由于血清中含有的很多未知成分会抑制或者刺激细胞，从而干扰实验，并且由于血清的不确定性，不同批次对于实验的影响也不同，造成了实验的重复性降低，因此我们推出不含血清的人间充质干细胞培养试剂盒，该试剂盒可有效避免因血清质量和血清组分变动对实验造成影响，提高细胞培养和实验结果的可重复性。
【主要组成成分】产品名称型号规格组成成份数量体积人间充质干细胞培养试剂盒A型（有酚红）500mL/Kit人间充质干细胞基础培养基(A型)1瓶475mL人间充质干细胞培养添加物1瓶25mL B型（无酚红）500mL/Kit人间充质干细胞基础培养基(B型)1瓶475mL人间充质干细胞培养添加物1瓶25mL【储存条件及有效期】人间充质干细胞基础培养基未开封并且2℃~8℃保存，有效期为1年；人间充质干细胞培养添加物未开封并且-25℃~-10℃保存，有效期为1年；两者混合后置于2℃~8℃保存，有效期2周。
【样本要求】1、细胞要求：原代培养或冻存复苏的人间充质干细胞；2、细胞悬液要求吹打混匀，成单细胞悬液。
【检验方法】准备工作1、准备25mL的人间充质干细胞培养添加物，37℃水浴解冻，若有沉淀析出，可用0.22μm细胞滤器过滤或4℃，3000g/10min离心取上清，该步骤不影响实验结果；2、准备475mL的人间充质干细胞基础培养基，恢复到室温；3、将人间充质干细胞培养添加物加入475mL人间充质干细胞基础培养基中，即可得到5%浓度的完全培养基；4、配置好的人间充质干细胞完全培养基可于2℃~8℃保存2周。
人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册说明书
产品描述人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册产品规格：400mL产品货号：PD-019人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基专门为人脐带间充质干细胞成脂诱导分化而开 发，针对人脐带间充质干细胞的特性优化分化试剂的配方，可增加人脐带间充质干细胞的成脂 分化效果。
本产品含血清成分，仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床及其他用途。
培养基组成成分●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP1：成分名称添加体积175 mL 20 mL 2 mL 2 mL 400μL 200μL 200μL 人脐带间充质干细胞成脂诱导分化诱导基础培养基 ADP1FBS谷氨酰胺 Glutamine青链霉素 Pennicillin-Streptomycin胰岛素 InsulinIBMX罗格列酮 Rosiglitazone地塞米松A Dexamethasone 200μL●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP2（维持培养基）成分名称添加体积人脐带间充质干细胞成脂诱导分化基础培养基 ADP2175 mL FBS20 mL 谷氨酰胺 Glutamine2 mL 青链霉素 Pennicillin-Streptomycin2 mL 胰岛素 Insulin 400μL油红-O 染色液 10 m L操作流程一、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基的准备注：各成分请根据试剂管上标签标示温度保存。
地塞米松A和地塞米松B浓度不同，不能混用。
染色液1.本产品为试剂盒型，使用前需将试剂盒内各成分试剂混匀。
（请勿将 ADP1 与 ADP2混淆）2.使用前，请将血清置于4℃解冻，直至血清完全溶解；待血清完全溶解后，将所有添加物置于室温溶解。
待试剂完全溶解后，轻轻摇晃使试剂混合均匀（低于 500μL 体积的试剂无需此操作）。
注：为了保证微量试剂的使用效果，请将低于 200μL 的试剂管进行短暂离心，使试剂能全部收集至管底。
3.按上述两个成分表，将表一 ADP1 中的 FBS、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松A等试剂按体积大小先后加入到诱导基础培养基中；混合均匀后做好标识，培养基即可使用。
BD破膜剂试剂手册中文
破膜剂试剂手册BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒手册（目录号554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注册商标。
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本出版物的任何部分不得以电子，机械，磁性，光学，化学，手册或其他方式以任何形式或通过任何方式复制，传播，转录，存储在检索系统中或翻译成任何语言或计算机语言，未经BD Biosciences事先书面许可。
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目录BD Cytofix / Cytoperm固定/渗透试剂盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂）警告和注意事项1.一般程序A.刺激细胞1.使用BD GolgiStop的程序蛋白质转运抑制剂（含有莫能菌素）2。
使用BD GolgiPlug 蛋白质转运抑制剂的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1收集细胞2.阻止Fc受体3.细胞表面抗原染色4.固定和渗透细胞5.备选固定和渗透方案6细胞内细胞因子染色C.流式细胞分析。
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BD Stemflow™Technical Data SheetHuman MSC Analysis KitProduct InformationMaterial Number:562245Size: 50 testsConfirmed: HumanReactivity:DescriptionHuman multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs), also referred to as mesenchymal stem cells, are a rare population of adult stem cellsthat can be isolated from a variety of tissues. MSCs that have been isolated from bone marrow and subsequently cultured can differentiate to avariety of cell types, most notably adipocytes, osteocytes and chondrocytes. MSCs also have immunomodulatory effects in vivo and in vitro.In 2006, the International Society for Cellular Therapy (ISCT) proposed a cell surface marker panel for the minimal identification of humanMSCs derived from bone marrow. Under this recommendation MSCs should be positive for CD73, CD90, and CD105, but be negative forCD34, CD45, CD11b or CD14, CD19 or CD79α, and HLA-DR. MSCs are also known to express numerous cell surface markers such asCD44, CD29, CD200, CD166, CD146 and CD271. In this kit we include the panel that was proposed by the ISCT. In addition, we designedthis kit to be modular so that additional markers could be “dropped-in”. Specifically, the MSC positive cocktail (FITC CD90, PerCP-Cy™5.5CD105 and APC CD73) leaves the PE channel open to use in combination with the supplied negative MSC cocktail (PE CD45, PE CD34, PECD11b, PE CD19 and PE HLA-DR), the included PE CD44 antibody conjugate, or a variety of other commercially available PE antibodyconjugates. Multi color analysis minimizes cell numbers required for an assay and antibody cocktails facilitate a streamlined staining protocolto analyze multiple samples. Individual positive markers are included for compensation set-up.Kit ComponentsComponent Description Size Vol. Per Test Storage Buffer51-9007661PE hMSC Negative Cocktail50 Test20 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007662PE hMSC Isotype Control Negative Cocktail50 Test20 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007663hMSC Positive Cocktail50 Test20 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007664hMSC Isotype Control Positive Cocktail50 Test20 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007657FITC Mouse Anti-Human CD9050 Test 5 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007656PE Mouse Anti-Human CD44100 Test 5 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007655PE Mouse IgG2b, k Isotype Control50 Test 5 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007649APC Mouse Anti-Human CD7350 Test 5 µl Aqueous buffered solution containingBSA and ≤0.09% sodium azide51-9007648PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD10550 Test 5 µl Aqueous buffered solution containing(Endoglin)BSA and ≤0.09% sodium azideDescription of Kit ComponentsVial Contents PurposehMSC Positive Cocktail CD90 FITC (Clone: 5E10)Cocktail to positively identify hMSCsCD105 PerCP-Cy5.5 (Clone: 266)CD73 APC (Clone: AD2)hMSC Positive Isotype Control Cocktail mIgG1, κ FITC (Clone: X40)Corresponding Isotype Control for hMSC PositivemIgG1, κ PerCP-Cy5.5 (Clone: X40)CocktailmIgG1, κ APC (Clone: X40)PE hMSC Negative Cocktail CD34 PE (Clone:581)Cocktail to identify potential contaminantsCD11b PE (Clone: ICRF44)CD19 PE (Clone: HIB19)CD45 PE (Clone: HI30)HLA-DR PE (Clone: G46-6)PE hMSC Negative Isotype Control Cocktail mIgG1, κ PE (Clone: X40)Corresponding isotype control for PE hMSCmIgG2a, κ PE (Clone:G155-178)Negative CocktailFITC Mouse Anti-human CD90CD90 FITC (Clone: 5E10)Compensation controlPE Mouse Anti-Human CD44CD44 PE (Clone: G44-26)Compensation control/MSC positive drop-in PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD105CD105 PerCP-Cy™5.5 (Clone: 266)Compensation controlAPC Mouse Anti-Human CD73CD73 APC (Clone:AD2)Compensation controlPE Mouse IgG2b, κ Isotype Control mIgG2b, κ (Clone: 27-35)Corresponding Isotype Control for PE MouseAnti-Human CD44, when used as a drop in Preparation and StorageStore undiluted at 4°C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze.The antibody was conjugated with R-PE under optimum conditions, and unconjugated antibody and free PE were removed.The antibody was conjugated with PerCP-Cy5.5 under optimum conditions, and unconjugated antibody and free PerCP-Cy5.5 were removed. Storage of PerCP-Cy5.5 conjugates in unoptimized diluent is not recommended and may result in loss of signal intensity.The antibody was conjugated with FITC under optimum conditions, and unreacted FITC was removed.The antibody was conjugated to APC under optimum conditions, and unconjugated antibody and free APC were removed.Application NotesApplicationFlow cytometry Tested During DevelopmentRecommended Assay Procedure:(1) Detach cells using BD™ Accutase™ Cell Detachment Solution (Cat. No 561527) or similar detachment solution, wash cells and resuspend ata concentration of 1x10^7 cells/ml in BD Pharmingen™ Stain Buffer (Cat. No. 554656) or other appropriate staining buffer.(a) Cells can also be resuspended at a concentration of 5x10^6 cells/ml if cell number is a limiting factor.(2) Label tubes and add antibodies as shown below:Tube Add (1 test size)(1)FITC Mouse Anti-Human CD90 (5µl)(2)PE Mouse Anti-Human CD44 (5µl)(3)PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD105 (5µl)(4)APC Mouse Anti-Human CD73 (5µl)(5)Nothing(6)hMSC Positive Isotype Control Cocktail (20µl)PE hMSC Negative Isotype Control Cocktail (20µl)(7)hMSC Positive Cocktail (20µl)PE hMSC Negative Cocktail (20µl)And/or(8)hMSC Positive Isotype Control Cocktail (20µl)Drop in isotype control (i.e. PE Mouse IgG2b, κ) (5 µl)(9)hMSC Positive Cocktail (20µl)PE Drop in (i.e. PE Mouse Anti-Human CD44) (5µl)(3) Repeat tubes 5-7 and/or 8-9 for each additional cell sample.(4) Add 100 µl of prepared cell suspension to tubes 1 through 9.(5) Incubate tubes in the dark for 30 minutes (May be done on ice or at room temp)(6) Wash the cells twice with BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) and resuspend at 300-500 µl in BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) . Alternatively, 1X Washing/Staining Solution (1 x PBS,1% FCS, and 0.09% sodium azide) may be used.(7) Analyze cells on flow cytometer(a) tubes 1-5 are to be used as controls to set up cytometer (i.e Compensation)Suggested Companion ProductsSizeCatalog Number Name Clone 554656Stain Buffer (FBS)500 ml(none)(none)561527Accutase™ Cell Detachment Solution100 mlTop: Schematic workflow of the human MSC analysis kit.Bottom: Cells grown in BD Mosaic™ hMSC SF Cell Culture Environment (Cat. No. 355700) were detached using BD™ Accutase™ CellDetachment Solution (Cat. No 561527) and then stained with the positive and negative cocktails (solid lines) or the positive and negativeisotype control cocktails (dashed lines). The plots were derived from gated events based on light scattering characteristics of the MSCs.Cells were analyzed using a BD™ LSRII flow cytometry system.Product Notices1.Accutase is a registered trademark of Innovative Cell Technologies, Inc.2.Please observe the following precautions: Absorption of visible light can significantly alter the energy transfer occurring in any tandem fluorochrome conjugate; therefore, we recommend that special precautions be taken (such as wrapping vials, tubes, or racks in aluminum foil) to prevent exposure of conjugated reagents, including cells stained with those reagents, to room illumination.3.This APC-conjugated reagent can be used in any flow cytometer equipped with a dye, HeNe, or red diode laser.PerCP-Cy5.5 is optimized for use with a single argon ion laser emitting 488-nm light. Because of the broad absorption spectrum of the4.tandem fluorochrome, extra care must be taken when using dual-laser cytometers, which may directly excite both PerCP and Cy5.5™. We recommend the use of cross-beam compensation during data acquisition or software compensation during data analysis.PerCP-Cy5.5–labelled antibodies can be used with FITC- and R-PE–labelled reagents in single-laser flow cytometers with no significant5.spectral overlap of PerCP-Cy5.5, FITC, and R-PE fluorescence.Cy is a trademark of Amersham Biosciences Limited. This conjugated product is sold under license to the following patents: US Patent Nos.6.5,486,616; 5,569,587; 5,569,766; 5,627,027.This product is subject to proprietary rights of Amersham Biosciences Corp. and Carnegie Mellon University and made and sold under7.license from Amersham Biosciences Corp. This product is licensed for sale only for research. It is not licensed for any other use. If you require a commercial license to use this product and do not have one return this material, unopened to BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121 and any money paid for the material will be refunded.8.Source of all serum proteins is from USDA inspected abattoirs located in the United States.9.Caution: Sodium azide yields highly toxic hydrazoic acid under acidic conditions. Dilute azide compounds in running water beforediscarding to avoid accumulation of potentially explosive deposits in plumbing.10.For fluorochrome spectra and suitable instrument settings, please refer to our Multicolor Flow Cytometry web page at/colors.11.Please refer to /pharmingen/protocols for technical protocols.ReferencesBühring HJ, Battula VL, Treml S, Schewe B, Kanz L, Vogel W. Novel markers for the prospective isolation of human MSC. Ann N Y Acad Sci. 2007;1106:262-271. (Biology: Flow cytometry)Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et. al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4):315-317. (Biology: Flow cytometry)Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M, et. al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy. 2005; 7(5):393-395. (Biology)Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter H, Bieback K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.Stem Cells. 2006; 24(5):1294-1301. (Biology: Flow cytometry)Sánchez L, Gutierrez-Aranda I, Ligero G, et al. Enrichment of Human ESC-Derived Multipotent Mesenchymal Stem Cells with Immunosuppressive andAnti-Inflammatory Properties Capable to Protect Against Experimental Inflammatory Bowel Disease. Stem Cells. 2010; 29(2):251-262. (Biology: Cell differentiation)。