分子标记及其在植物遗传育种中的应用

主要特点
• 无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； • 需要量少，引物便宜，成本较低； • 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂
交和放射性自显影等技术。 • 不同物种间引物通用； • 缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合
子；实验重复性较差，结果可靠性较低。
( )：
与不同的是: 引物浓度更高，引物长度更短（一般5－8
生化标记——贮藏蛋白和同 工酶
贮藏蛋白 同工酶 特点：经济、方便、成本较低 结构基因表达产物，对非结构基因无能
为力；所检测位点只是基因组一部分； 数量有限，有时受发育时期和环境影响。
分子标记
本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，
5'
GCTCGC
3'
denature @ 95˚ C
AGTACT 3' 5'
5'
GCTCGC
3'
CGGCATCGGCCG
AGTACT 3' TCATGA TCATGA 5'
anneal primers @ 60˚ C
Taq polymerase binds 3’ and extends
5'
GCTCGC
分子标记及其在植 物遗传育种中的应
用
遗传标记
（）
• 性状标记
具有多型性
• 色泽， 形态… • 细胞学标记
易于鉴别
• 倒位，易位，带…
与目标基因紧密连 • 生化标记
锁
• 同功酶…
• 分子标记
• 、、、、… …
基础基因表达
结果 表现型
碱基 序列变异
形态标记
遗传学上稳定、可见的外部特征 遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等
如SSR、STS等
植物遗传研究中常用的分子标记
— — (, ) — —
原理： 限制性内切酶酶切 电泳 转移到硝酸纤维素滤膜 同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂
交 胶片放射自显影，显示酶切片段大小
酶切—电泳—印迹
酶切：3-5 ，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 染色：染色20分钟 变性：0.25M 20分钟，抽真空，水冼 印迹：加入0.4N ，进行 印迹 冲洗：以2× 冼胶，风干
稳定、重复性强
某些植物中开发探针已遍及整个基因组
缺点：需要量较大，技术复杂；
用于做图较费时，难以分析大量样品；
在基因组较大、严格自花授粉作物上多
态性很低，使遗传图饱和度低。
原理：
用一个随机引物（8-10）、碱基随机 排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增 基因组，然后电泳分开扩增片段。
Target DNA sequence
缺点：
对反应条件非常敏感，重复性差。
（）
为提高标记稳定性，把目标片段克隆测序， 根据片段两末端的序列设计特定引物（通 常24个碱基），再进行扩增，可把相应的 单一位点鉴定出来。
具有更高的可重复性 共显性
微卫星标记()
真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约 每隔10-50就存在一个.
哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均 23.3有一个;双子叶植物数量大于单子叶植物 ,核 数量多于细胞质;
GCTCGC
3'
CGAGCG
AGTACT 3' TCATGA TCATGA 5'
Repeat 25-40 times
的操作
反应：
（20µl） 1µl
15
10×
2.0µl
2+（25）
1.2µl
酶（5µl） 0.15µl
（25） 0.2µl
扩增：
1 95℃ 2分钟 2 95℃ 15秒 3 36℃ 30秒 4 72℃ 45秒 5 2 46循环 6 72℃ 5分钟
—杂交—洗脱
预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5× 、 Ⅲ）中， 封好后置65℃温箱中振荡5－6小 时。
杂交：预杂交液中加入标记好的和探针，放 入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65℃温箱 中振荡过夜。
洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃ 振荡洗脱两次（15次），吸干包好。
—放射自显影
将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室 中将 光片放于杂交膜上， 再放上另一张 增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置70℃超低温冰箱中曝光10天左右。 使用磷屏仪，操作更方便。
与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂
合基因型，提供完整的信息。
分子标记的分类（等1996）
以Southern为基础如RFLP
分
子
单引物PCR标记 有RAPD、
标
AP-PCR、DAF、ISSR等
记 以PCR 双引物选择性扩增PCR 主要指AFLP
为基础 需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记
根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、 2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。
的分布特点
不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核和28个植物种细胞器 (1-
4)的搜索,发现： ()ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、()n、
探针
来源：探针与基因组（）探针 探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。 探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异
性较强。 玉米探针：.
探针标记—随机引物法
25 变性 5 寡聚核苷酸 2 3 [α-32P] 2酶 加水至50ຫໍສະໝຸດ Baidu37℃温箱中标记2小时
标记特点
共显性，可以区别纯合和杂合基因型
个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳， 通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比 大得多。 （等，1990）
()
引物较长（10～50）； 引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它
目的而设计的引物（如M13通用测序 引物）。
共同优点：
在不需要知道所扩增序列情况下，产
生片段的指纹；
需量少，产生多态性丰富。
环节，表型差异有时难以反映基因型差异。
细胞学标记
染色体数目变异及结构变异，表现在染色体 核型（数目、大小、随体、着丝点位置等） 和带型（C带、N带、G带等）。
随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展， 可在染色体水平揭示更多遗传变异。
特点：直观、快速而经济，但变异十分有限， 当染色体数目形态相似时难以分辨。