8-4 液相色谱之体积排阻色谱
体积排阻色谱
一. 分离原理尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。
排阻色谱的固定相多为凝胶。
凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。
凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。
尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。
尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。
因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。
经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。
当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。
当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：Xm ⇌ Xn组分的分配系数为：尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1二. 固定相尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。
无机凝胶：又称硬质凝胶。
是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。
有机凝胶：又称半硬质凝胶。
如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。
但在有机溶剂中有轻度膨胀。
新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。
三. 流动相尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等。
(可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)。
液相色谱法
分离度方程
选择因子
柱效
容量因子
k’ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 α 是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度
塔板理论
塔板模型假设色谱柱是由大量分离 层构成的，这些分离层称之为理论 塔板 这些塔板实际是不存在的，他们只 是一种假设用来帮助描述色谱柱里 所发生的一切 在这些塔板里面，固定相和流动 相之间存在着一种平衡。分析物在 这种平衡里面存在着一种平衡系数K， 定义为： K = C固定相/ C流动相 随着K的增加，分析物从色谱柱中 的流出时间就越长，即分析物的在 色谱柱内的保留时间越长
易受到细菌和霉菌的影响
不能直接用有机溶剂冲洗
（二）管路中不断有气泡生成
故障：吸滤头堵塞 措施：用5％～20％的稀硝酸，超声波清洗（玻
璃材质的浸泡）， 再用蒸馏水清洗。
注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断
（三）泵无法吸液或排液，流路不通
故障：单向阀中宝石球粘附于垫片 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压， 使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中， 用超声波清洗
6. 使用缓冲盐后，要先用含10%甲醇的水溶液冲洗， 再用有机溶剂冲洗
7. 流动相正相反相转换时用异丙醇过渡
色谱柱的存放 存放前充分冲洗 合适的存放溶剂 接好堵头，避免固定相干涸 存放环境
柱温箱
分析结果重现性好
提高柱效 降低柱压
保证检测稳定性
常用检测器
紫外可见光检测器 (UV)
二极管阵列检测器（PDA） 荧光检测器（RF） 示差折光检测器 (RID） 蒸发光散射检测器（ELSD） 电导检测器（CDD） 质谱检测器（MS）
液相色谱
(二)、HPLC与GC异同点
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能分 析20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱 效 有很灵敏的检测器如ECD和较 灵敏的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒，易于处 理 运行和操作容易 仪器制造难度较小 高效液相色谱 几乎可以分析各种物质
高效液相色谱的分类
1 按固定相的聚集状态可分为：
• 液液色谱法(LLC)
• 液固色谱法(LSC)
2 按分离机制可分为：
• 分配色谱法
• 吸附色谱法
• 化学键合相色谱法 • 离子交换色谱法
• 分子排阻色谱法
• 亲和色谱法
四、流程及主要部件
process and main assembly of HPLC
。亲和力大，保留时间长。
阳离子交换： 阴离子交换： 离子交换反应达到平衡时，保留值决定于平衡常数。容量因子 k’ 与平衡常数 K 成正比，且与流动相中的反离子浓度（ M+ 、 X- ） 成反比。 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离 子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白质等。
四、 离子对色谱
ion pair chromatography 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（ 对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏 水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；
食品仪器分析-高效液相色谱参考答案
高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。
2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。
3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。
4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。
6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。
反之称为反相色谱。
7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。
8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。
9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。
二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。
（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。
（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。
（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。
TSKgel PW系列水相分子尺寸排阻色谱柱使用说明书
水相分子尺寸排阻色谱柱TSKgel PW系列使用说明书东曹株式会社安全注意事项［注意标签］■远离火源使用易燃溶剂时，请务必小心。
否则可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■使用环境必须通风良好如果通风不良，易燃或有毒溶剂可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■请勿喷洒溶剂溶剂发生喷洒或泄露可能会导致火灾、触电、中毒、受伤以及腐蚀。
清除漏出的溶剂时，请佩戴合适的护具。
■请佩戴护目镜和防护手套有机溶剂和酸属于有害物质，切勿直接接触皮肤。
■请小心处理包装处理不当可能会导致产品破裂或溶剂飞溅。
■请勿将本产品用于其他目的本产品仅可用于分离和提纯，请勿用于其他用途。
■请确认化合物的安全性请确认分离和提纯后的化合物和溶剂安全可靠。
■正确废弃请根据当地法律法规正确废弃。
注请将本说明书保存在本产品附近，以便日后参阅。
目录1. 简介 (1)2. 打开包装 (1)3. 色谱柱部件 (2)4. 安装 (2)5. 维护 (3)6. 溶剂 (4)7. 流速 (6)8. 温度 (8)9. 准备样品 (8)10. 理论塔板数和不对称因子的计算方法 (9)11. 保护柱 (10)12. 故障排除 (11)13. 质量标准和质量保证 (13)1. 简介TSKgel PW系列色谱柱是东曹株式会社开发的高效液相色谱柱，主要用于水相高效凝胶过滤色谱（GFC），适用于各类水溶性物质。
该类色谱柱适用于水溶性合成聚合物、低聚物以及生物物质，如多糖、核酸、蛋白质、肽等的分析或制备。
请仔细阅读本使用说明书，确保正确、有效地使用该类色谱柱。
表1应用领域应用领域适用的色谱柱水溶性合成聚合物水溶性生物聚合物多糖G4000PW(XL)，G5000PW(XL)，G6000PW(XL)，GMPW(XL)水溶性低聚物肽G2500PW(XL)，G3000PW(XL)非离子低聚物（低聚糖）G-Oligo-PW，G2000PW核酸G-DNA-PW注：TSKgel G-Oligo-PW和G2000PW可以在较宽的pH值范围内吸附离子型样品。
高效液相色谱在生物制药中的应用
高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。
高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。
以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。
于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。
鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。
随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。
高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。
1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。
高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。
②高效：分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。
⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。
高效液相色谱有5种类型：1、吸附色谱（Adsorption Chromatography）2、分配色谱（Partition Chromatography）3、离子色谱（Ion Chromatography）4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）5、亲和色谱（Affinity Chromatography）此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点。
体积排阻色谱 (sec)柱用的仪器
体积排阻色谱(sec)柱用的仪器全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种常用的色谱技术，也称为凝胶过滤色谱，它基于分子在流体中的尺寸和形状的差异，从而实现对分子的分离和分析。
而在SEC技术中，柱是至关重要的部分，体积排阻色谱柱是SEC技术中使用的一种特殊类型的柱，下面将详细介绍体积排阻色谱柱用的仪器。
1. 体积排阻色谱柱的特点体积排阻色谱柱是一种工程化的柱，与常规液相色谱柱有所不同。
它具有以下特点：（1）外围设计：体积排阻色谱柱通常采用不锈钢或者玻璃材质制成，外围设计均匀、结构合理，能够有效支持柱内填料，确保填料不会受到外力破坏。
（2）填料选择：体积排阻色谱柱的填料通常是粒径均匀的多孔球形颗粒，具有一定的孔径范围，能够较好地分离分子。
（3）稳定性：体积排阻色谱柱能够在一定的操作条件下保持较好的稳定性，不易受到外界影响而发生变形或损坏。
（4）易于连接：体积排阻色谱柱通常设计成易于连接的结构，可以与其他色谱设备灵活组装，便于操作和维护。
在体积排阻色谱实验中，除了色谱柱外，还需要配备一系列的仪器，以确保实验顺利进行。
主要的仪器包括：（1）色谱系统：用于将样品注入到色谱柱中，并控制流速、温度等操作参数。
色谱系统通常包括进样器、泵、检测器等部件。
（2）检测器：用于监测样品在色谱柱中的运动轨迹并进行信号采集和处理。
常见的检测器包括紫外检测器、荧光检测器、光散射检测器等。
（3）设备连接：用于连接色谱柱和其他仪器，包括管道、接头、密封件等。
这些连接件需要具有良好的密封性能，以避免样品泄漏。
（4）温控设备：用于控制色谱柱和样品的温度，以确保实验在恒定的温度条件下进行。
在选择和使用体积排阻色谱柱时，需要注意以下几点：（1）填料选择：根据待分离的目标分子的分子量范围，选择合适的填料颗粒大小和孔径范围。
（2）流速控制：流速对于色谱分离效果至关重要，需要根据实验要求合理设置流速。
8-4 液相色谱之体积排阻色谱
体积排阻色谱法
体积排阻色谱法的分离原理
SEC分离机理
SEC原理
SEC分离机理
固定相
无机填料（多孔硅胶或多孔玻璃）
优点：可以耐高温；机械性能稳定
缺点：表面具有吸附性，干扰SEC分离机理(硅烷化)有机填料（交联聚苯乙烯凝胶）【广泛使用】
优点：渗透性能好；柱效高
缺点：不宜长期高温条件使用
流动相
流动相的要求
•能完全溶解试样；但不与试样反应；
•不与填料有任何相互作用；
•黏度低；沸点比柱温高20-50摄氏度
•与检测器匹配，提高灵敏度。
SEC方法特点
•保留时间是分子尺寸的函数
•保留时间短，谱峰窄，容易检测
•柱子使用寿命长（固定相与组分作用力弱）
•不能分辨分子大小相近的化合物（相差10%以上）。
尺寸排阻色谱法原理
尺寸排阻色谱法原理体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。
在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。
今天就和大家一起看一看SEC的原理、实验条件选择、应用、常见问题及解决办法，我们一起分享学习。
定义排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
分类1、凝胶过滤色谱法-GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
2、凝胶渗透色谱法-GPC主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
基本原理凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。
分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。
排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。
两种排阻色谱类型比较固定相与流动相流动相的选择1、必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。
2、溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
3、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
固定相（凝胶）一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
分类：1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
仪器分析9-经典液相色谱法概要
2.液相色谱的固定相和流淌相
3〕常用有机吸附剂
① 聚酰胺 为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙
醇等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定 性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。
2.液相色谱的固定相和流淌相
聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附，通 过分子中的酰胺羰基与酚类，或酰胺键上的游 离氨基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔 合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种化合 物与之形成氢键缔合的力量。
2.液相色谱的固定相和流淌相
2〕常用无机吸附剂
① 硅胶〔SiO2·H2O〕
硅胶为极性吸附剂，外表主要存在着硅羟基〔硅 醇基〕和暴露于外表的Si-O-Si键，另外还有一些硅 醇基可能与水以氢键键合。硅羟基的外表浓度在吸 附色谱中很重要，由于人们通常认为硅羟基是强吸 附位点，而Si-O-Si则是疏水性的。
氧化铝的活性与其含水量相关。
2.液相色谱的固定相和流淌相
氧化铝适宜分别溶于有机溶剂的极性、弱极 性的非强离解型的化合物，尤其适合于分别芳 香族化合物。当样品为碱性化合物时，用硅胶 分别会造成严峻吸附，此时可选用氧化铝进展 分别，但酸性易离解的化合物简洁在氧化铝上 形成死吸附。
氧化铝分别几何异构体力量优于硅胶。
2.液相色谱的固定相和流淌相
(3) 离子交换树脂的性质 1) 离子交换树脂的特性
二乙烯苯
重量交联度：树脂中所合交联剂的百分率。
树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大 的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择 性；另外，交联度大时，形成的树脂构造严密，机 械强度高。但是假设交联度过大则对水的膨胀性能 差，交换反响的速度慢，因此要求树脂的交联度一 般为8-12％。
2.液相色谱的固定相和流淌相
高效体积排阻色谱测定氧化甘油三酯聚合物相对分子质量
高效体积排阻色谱测定氧化甘油三酯聚合物相对分子质量薛斌;曹文明【摘要】通过将油脂的极性组分分离提取后,采用高效体积排阻凝胶色谱技术,以标准相对分子质量的聚苯乙烯为标准对照,对2个精炼餐厨废油脂样品(1个泔水油和1个煎炸老油)的极性组分中氧化甘油三酯二聚物(TGD)、氧化甘油三酯寡聚物(TGO)和氧化甘油三酯(Ox-TG)单体的相对分子质量进行了间接测定,再用三油酸甘油酯标准物质对测定的相对分子质量进行校正,同时考察TGO、TGD与Ox-TG单体的平均相对分子质量(质均)的关系.结果发现:TGD的平均相对分子质量要比Ox-TG单体平均相对分子质量的2倍小80 ～ 105,TGO的平均相对分子质量比Ox-TG单体平均相对分子质量的3倍小180～ 225.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2013(038)010【总页数】4页(P87-90)【关键词】高效体积排阻色谱;氧化甘油三酯聚合物;相对分子质量;地沟油【作者】薛斌;曹文明【作者单位】江南大学食品学院,江苏无锡214122;上海市粮食科学研究所,上海200136;江南大学食品学院,江苏无锡214122;上海市粮食科学研究所,上海200136【正文语种】中文【中图分类】TS225;TQ646天然食用油脂在加工、煎炸和储藏过程中，其主要成分——甘油三酯会发生氧化反应形成氧化甘油三酯(oxidized triglycerides，Ox－TG)，进而以这些氧化甘油三酯为单体，相互发生聚合反应形成氧化甘油三酯聚合物(oxidized triglycerides polymers，TGP)，氧化甘油三酯可根据其聚合度的不同分为氧化甘油三酯二聚物(oxidized triglycerides dimmer，TGD)和氧化甘油三酯寡聚物(oxidized triglycerides oligomer，TGO)［1－3］。
TGP 与油脂的氧化程度存在关联性［4－6］。
高效液相色谱法(1)
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O H3C-C-N-C-O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
为了获得合适的溶剂强度(极性),常采用二元或 多元组合的溶剂体系作为流动相.
采用的溶剂可分为底剂及洗脱剂两部分
底剂决定基本的色谱分离, 洗脱剂具有对组分选择性分离
正相色谱中底剂采用低极性溶剂,洗脱剂选择极 性较强的溶剂.
反相色谱中底剂采用强极性溶剂(水),洗脱剂选 择极性较弱的溶剂(有机溶剂).
离子交换色谱主要在含水介质中进行,组分保 留值可以用流动相中盐的浓度和 pH来控制,增加 盐的浓度导致保留值降低,由于流动相离子与交 换树脂相互作用力不同,因此流动相中离子类型 对样品组分的保留值有显著影响.
30KD
50KD
15
20
25
30
Ion Exchange Chrom
protein B protein B Prot ein B
Prot ein A
-- Na+ SO3+ CM
Prot ein B Pro tei nA
常用填料： 磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸 酯、表面改性硅胶等… 分类： 阳离子交换、阴离子交换
反相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；机理-被分离
物的与固定相的疏水相互作用力的差别；流动相-极性的有机溶 剂或水；分离-范围最广。
RPC
体积排阻色谱在蛋白质药物聚集体领域的应用
体积排阻色谱在蛋白质药物聚集体领域的应用张晓敏;胡志上;李红梅【摘要】蛋白质聚集现象是生物制药行业面临的重大问题之一,对蛋白质药物有效性、安全性、质量可控性有很大影响.体积排阻色谱技术是蛋白质药物及其聚集体检测分析的标准技术,具有操作简单、分离条件温和、基本不破坏蛋白质药物结构等优点.但由于蛋白质与固定相存在非特异性相互作用,采用该法检测时存在洗脱延迟、色谱峰拖尾、基线漂移、蛋白质回收率低等问题.该文介绍了体积排阻色谱的分离原理及实际应用,并对该技术在蛋白质药物检测中存在的非特异性吸附问题及相关方法优化做了简要概述.同时列举了几种与体积排阻色谱互补的可用于蛋白质药物聚集体分析的技术.最后,对体积排阻色谱技术的发展前景进行了展望.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2019(038)007【总页数】7页(P882-888)【关键词】体积排阻色谱;蛋白质药物;蛋白质聚集体;非特异性相互作用【作者】张晓敏;胡志上;李红梅【作者单位】北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;中国计量科学研究院,北京100013;中国计量科学研究院,北京100013【正文语种】中文【中图分类】O657.7蛋白质药物是目前销售额最大的生物治疗药物[1]，蛋白质本身非常不稳定，其结构中非共价键的稳定性很容易被外力因素( 如摇动、温度等)破坏。
加热、延长保存、有机溶剂、氧气、pH值改变及其他多种因素均可引起蛋白质结构改变。
作为蛋白质产品的蛋白药，在生产过程中需要进行酸处理、热处理和机械处理，这些过程中都有可能产生蛋白质折叠甚至聚集；蛋白药在贮藏、运输、销售以及用药过程中由于外力因素的作用也可能会产生聚集。
蛋白质聚集现象会导致蛋白药活性降低，药品中的蛋白单体浓度降低，并可能产生有害的毒理学作用和免疫应答，甚至会发生危及生命安全的药物反应[2]。
体积排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)灵敏度良好、操作简单、样品前处理少、分析速度快、分离条件温和[3]，自重组蛋白药物诞生以来一直是蛋白质药物聚集体表征的金标准[4-6]。
GPC
– 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯 共聚物
高聚物的性能特别是机械性能、加工性
能及高分子在溶液中的特性等都与高聚物分 子量有关。如冲击强度、模量、拉伸强度、 耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分 子量分布有关(分子量低易碎，分子量高难加工)。例 如，一般的聚苯乙烯制品平均分子量为十几 万，如果分子量低到几千极易粉碎，几乎没 有应用价值。当分子量达到20万以上时，其 机械性能较好，但分子量达到百万以上时， 又难以加工，也失去实用价值。
一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在 0.05~0.5%（质量分数）范围内配置。分子质量越 大，溶液浓度越低。
标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室 温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超 声或者剧烈振荡来加速溶解。
溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入 色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。
2 17.0
3
4 5
6 7
8
18.0
19.0
20.0
21.0 min
mV(x10) Detector B
1.0
样品分析结果
17.723
0.0
-1.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
Mn
Mw
Mz
Mz1
Mw/Mn Mz/Mw
43679 73178 101377 125121 1.67534 1.38536
结果评价示例
PS1和PS2为同一操作人员测定同一样品的两次测定结果 PS3为另一实验室对同一样品测得的结果
例
一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法
一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法体积排阻色谱法（GPC）是一种常用的高效液相色谱技术，用于测定聚合物的分子量和分子量分布。
在测定玻璃酸钠（Sodium Polyacrylate）的分子量和分子量分布时，可以采用GPC方法。
首先，准备样品。
将玻璃酸钠溶解在适量的溶剂中，以获得适量的样品浓度用于后续的分析。
然后，准备分析设备。
GPC测试仪由溶剂供给系统、柱列、检测器和数据处理系统等组成。
选择合适的溶剂系统和柱列可以根据待测聚合物的特性来确定。
一般来说，对于玻璃酸钠这种高分子聚合物，常用的柱列材料是聚合物基质，如聚乙烯醇（Polyethylene Glycol，PEG）柱。
检测器一般选择紫外（UV）检测器或折射率检测器。
接下来，进行分析实验。
将样品注入至柱列，并通过溶剂系统推动样品在柱内流动。
溶剂的选择应根据样品的特性和柱列的要求进行选择，一般选择合适浓度的盐酸或醋酸溶液作为溶剂。
样品在柱内的流动速率应适中，一般设置在0.5-2.0 mL/min。
待测聚合物随着溶剂流动，根据其分子量的大小被阻滞在不同的柱孔内，从而实现分子量的分离和分析。
在柱列出口的检测器处，通过监测样品的吸收或折射率变化，可以得到聚合物在不同分子量下的峰面积。
最后，数据处理和结果分析。
通过测量峰面积，并根据标准物质建立的标准曲线得到样品的分子量，进而可以计算出玻璃酸钠的平均分子量和分子量分布。
可以采用软件分析工具进行数据处理和绘图。
需要注意的是，进行GPC测定时需谨慎选择柱列和检测器，以确保溶剂的纯净度和柱列的分析效果。
同时，合理的样品浓度和流速选择也对结果的准确性有较大影响。
此外，样品的前处理和样品的制备也需要注意，以避免引入其他干扰物质。
综上所述，采用体积排阻色谱法可以较为准确地测定玻璃酸钠的分子量和分子量分布。
该方法可用于聚合物领域的科学研究和工业生产中，为合成和应用高分子材料提供了技术支持。
一种新颖的体积排阻色谱加宽效应的去除方法I理论测试
一种新颖的体积排阻色谱加宽效应的去除方法I理论测试体积排阻色谱是一种有效的分离技术，但在实际应用中常常遭遇分辨力不足和峰形加宽等问题。
体积排阻色谱加宽效应是指在分析色谱中，由于溶剂扩散效应、柱床形貌和质量传递的复杂影响，在峰的底部出现加宽现象，导致分辨率降低，峰形恶化。
为了解决这一问题，本文提出了一种新颖的去除方法，通过理论测试验证其有效性。
一、体积排阻色谱加宽效应的机理1.溶剂扩散效应：在高效液相色谱中，溶质在溶剂中的扩散速度可能导致峰的加宽。
2.柱床形貌：柱床粒径的不均匀性、孔隙度等参数对色谱分析的分辨率和峰形都有较大影响。
3.质量传递效应：流经柱床的溶液在吸附相和流动相间传递质量，导致峰的加宽。
二、新颖的去除方法针对体积排阻色谱加宽效应，本文提出了一种基于傅里叶变换的去除方法。
具体步骤如下：1.根据实验数据，利用傅里叶变换将信号频谱转换到频域。
2.通过分析频谱得到加宽现象的频率特征。
3.针对加宽频率特征设计相应的去除滤波器。
4.将去除滤波器应用于原始信号，去除加宽效应。
三、理论测试为了验证新方法的有效性，进行了理论测试。
首先，选择一组具有加宽效应的色谱数据作为测试基准。
然后，利用上述方法处理这组数据，通过比对处理前后的色谱图，分析峰形和分辨率的变化。
在测试中，发现经过新方法处理后的色谱图峰形变窄，分辨率明显提高。
同时，与传统去除方法相比，新方法更有效地去除了加宽效应，保留了原始信号的信息完整性。
四、结论与展望通过理论测试，证明了新方法在去除体积排阻色谱加宽效应方面具有较好的效果。
未来，可以进一步深入研究该方法的机理和应用，优化参数，实现更广泛的应用。
同时，结合实验验证，探索更多适用于实际分析的去除方法，提高色谱分析的准确性和稳定性。
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体积排阻色谱法
体积排阻色谱法的分离原理
SEC分离机理
SEC原理
SEC分离机理
固定相
无机填料（多孔硅胶或多孔玻璃）
优点：可以耐高温；机械性能稳定
缺点：表面具有吸附性，干扰SEC分离机理(硅烷化)有机填料（交联聚苯乙烯凝胶）【广泛使用】
优点：渗透性能好；柱效高
缺点：不宜长期高温条件使用
流动相
流动相的要求
•能完全溶解试样；但不与试样反应；
•不与填料有任何相互作用；
•黏度低；沸点比柱温高20-50摄氏度
•与检测器匹配，提高灵敏度。
SEC方法特点
•保留时间是分子尺寸的函数
•保留时间短，谱峰窄，容易检测
•柱子使用寿命长（固定相与组分作用力弱）
•不能分辨分子大小相近的化合物（相差10%以上）。