免疫细胞化学 (abcam新版指南)ICC-IMMUNOCYTOCHEMISTRY
免疫组化教程
第一章免疫细胞化学基本概念及发展简史一．免疫细胞化学的基本概念免疫细胞化学（immunocytochemistry)是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原(或抗体)的定位和定量的技术。
应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。
从而为生物医学研究生命大分子,特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。
二．免疫细胞化学的发展简史1941年，Coons等创立了荧光抗体法1959年，Singer创立了铁蛋白法1966年，Nakane等创立了免疫酶技术1971年，Faulk和Taylor 创立了免疫胶体金法1976年，Bayer等提出了亲合组织化学法第二章免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术一．取材（一）组织标本的取材1.活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。
2.取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。
必要时取远离病变区的正常组织作为对照。
3.为充分保存组织的抗原性，取材要快，尽量保持组织新鲜。
（二）细胞标本的取材1．印片法应用：活检标本、手术切除的标本。
方法:新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中5－10分钟，取出自然干燥,低温保存。
优点:简便省时，细胞抗原保存较好。
缺点:细胞分布不均重叠，影响标记效果.2．穿刺吸取涂片法应用：实质器官的病变区.方法：①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。
②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升Hanks液（RPMI1640液）内，轻搅，500rpm离心5－10分钟，弃上清，制成细胞悬液(2x106细胞/ml)，吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。
优点：细胞均匀.缺点：细胞易变形。
3．体液沉淀涂片法①细胞数多，取一滴直接涂片。
②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。
免疫组化绪论
绪论
第一节
免疫组织化学的基本概念
概念：免疫组织化学 (Immunohistochemistry,IHC)又称免疫细胞 化学(Immunocytochemistry,ICC)，是用免 疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标 本中的某些化学成分进行原位的定性、定位 或定量检测技术。
抗原：蛋白质、多肽、酶、核酸、激素、多糖、 磷脂、受体等
原理： 1.利用抗原与抗体之间结合具有高度特异性的特 点，将组织活细胞中的某些化学物质提取出来， 以此作为抗原或半抗原，通过免疫获得相应的 特异性抗体，再以此抗体去检测组织或细胞中 的抗原。
2.在已知的抗体上标记显色剂，通过组织化学显 色反应呈现一定的颜色。
举例1： 分布部位 1、角蛋白 （Keratin） ： 上皮组织（表皮，间皮、 消化道粘膜上皮，腺上皮，内脏非角化上皮） 2 、波形蛋白 （Vimentin） ： 间叶组织（成纤维细 胞，软骨细胞，巨噬细胞，内皮细胞，黑色素细胞等。 3、上皮膜抗原（EMA）：广泛分布于各种正常上皮 细胞膜及肿瘤中。 4、癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。主要存在腺上皮来源的腺 癌中。 5、白细胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B细胞，单核细胞，粒细胞表面。 6、S-100蛋白，是一种酸性钙结合蛋白，主要存在于 中枢神经系统各部的星状神经胶质细胞的胞液中
第四节 免疫组化的优点
特点或优点： （1）特异性强 ； （2）灵敏度高； （3）方法统一，定位准确
这里必须强调免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原 则：
①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染 色的形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。 不能把免疫组化染色作为诊断的“金标准”。 ②免疫组化不能用于良、恶性的判断。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC）定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
Moc-31、EMA、CEA在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用
Moc-31、EMA、CEA在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用罗锦;朱正鹏;贾国凤;方静怡;马健波;张睿【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(000)010【摘要】目的：探讨Moc-31、EMA、CEA在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用价值。
方法136例胸腹水标本行细胞涂片瑞氏染色、细胞块 HE 及免疫细胞化学( immunocytochemis-try, ICC) SP法染色并观察。
结果细胞形态学结合ICC染色分析后,恶性胸腹水检出率由22．1%(30/136)提高到30．9%(42/136)。
Moc-31、EMA、CEA在恶性和良性胸腹水中的阳性率分别为95．2%和1．1%、92．9%和16．0%、88．1%和0．0。
三者在良恶性胸腹水中的表达差异有统计学意义(P<0．01)；其中Moc-31敏感性最高,CEA特异性最高。
同时通过联合检测其他免疫指标证实肿瘤细胞的组织学来源。
结论应用胸腹水细胞块ICC技术联合检测Moc-31、CEA、EMA,能显著提高细胞学诊断的准确性；同步检测其他免疫标记可以进一步明确其组织学分型及来源。
【总页数】3页(P1177-1179)【作者】罗锦;朱正鹏;贾国凤;方静怡;马健波;张睿【作者单位】湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008;湖北医药学院附属东风医院病理科，十堰 442008【正文语种】中文【中图分类】R730.4【相关文献】1.CEAmRNA、CEA蛋白检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值 [J], 陈杰;张雪华;张行;潘锵荣2.液基细胞学检测联合DNA倍体分析在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用 [J], 王应霞;张旋;吴莹莹;舒然;潘国庆3.pH与CEA及CA-199联合检测对良恶性胸腹水的鉴别诊断价值 [J], 钱同胜;刘云4.MOC-31和CD44v6在良恶性腹水鉴别诊断中的应用 [J], 陈江帆;姜海娇;祝迪;王秀茹;李建华5.细胞形态学结合胸腹水／血清CEA比值在良恶性胸腹水鉴别诊断中价值 [J], 杨志军;王玉平;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫组化060614
又 称 为 免 疫 组 化 (Immunohistochemistry ， IHC)
– 是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学 反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离 子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要 是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量 的研究，称为～。
(一) 对抗原和抗体的要求
(3) 免疫方法
(4) 免疫剂量 (5) 抗体效价的测定 (6) 抗体的纯化
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
所需抗血清的量
– 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提 供几升。
能供免疫用的抗原量
– 小鼠50g足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择
动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之
– 先 在 其 两 脚 垫 注 射 完 全 福 氏 佐 剂 0.2ml(卡 介 苗 每 兔 5mg)； – 10天后，见腋窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大 的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳 化； – 以后每隔两周用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方 法加强2次，各次注射的抗原均为25～50g；
– 兔耳放血进行抗体效价检测。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
初次免疫
– 用10～100g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6 点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
加强免疫
– 每隔 7～8天，将10～50g Ag于PBS或FIA中。 在肌肉、皮下或静脉注射；
抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
优点：简单、快速、节省材料。
乳化好的标志
判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液
体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持 圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用
免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用引言：免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种基于抗体与抗原特异性反应的特殊染色技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围。
在肿瘤诊断中，免疫组织化学技术被广泛应用于肿瘤类型鉴定、预后判断和治疗选择等方面，并逐渐成为肿瘤诊断领域的重要工具。
一、肿瘤类型鉴定免疫组织化学技术可通过检测肿瘤标志物的表达情况来确定肿瘤的类型。
不同类型的肿瘤会表达特定蛋白，通过观察这些蛋白的表达情况，可以为准确诊断提供线索。
例如，在乳腺癌中，雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的阳性表达对于判断患者是否适合内分泌治疗非常重要；HER2蛋白过度表达或基因扩增则与Herceptin治疗的有效性相关。
另外，通过检测细胞角蛋白、细胞间连接蛋白等标志物的表达情况，可以帮助判断肿瘤是否来源于上皮组织或间质组织。
二、预后判断免疫组织化学技术在预后判断方面也具有重要意义。
通过评估肿瘤标志物的表达强度和分布范围，可以对患者的生存期和复发风险进行初步判断。
例如，在乳腺癌中，Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的标志物，其高表达往往与较差的预后相关；p53蛋白过度表达与恶性程度增加以及放化疗抵抗有关。
通过检测这些标志物，可以为患者提供更加个体化和精确的治疗方案。
三、治疗选择免疫组织化学技术在治疗选择方面也能够发挥作用。
目前很多靶向药物的应用都会依赖于特定分子标志物在患者肿瘤组织中的表达情况。
通过检测这些标志物，可以确定患者是否适合接受特定的靶向治疗。
例如，EGFR是结肠癌中艾司唑仑的治疗标志物；ROS1在非小细胞肺癌患者中能够预测克唑替尼的应用效果。
四、技术进展与挑战随着免疫组织化学技术的不断发展，一些新的标志物已经被引入到临床实践中。
如PD-L1在肺癌和其他恶性肿瘤中的表达与免疫检查点抑制剂治疗反应相关；BRCA1/2基因突变是用于判断乳腺和卵巢癌家族遗传风险和药物敏感性的重要指标。
免疫细胞化学ICC流程
免疫细胞化学ICC检测流程（本方法适用于贴壁型细胞作爬片及检测）细胞片制作1）细胞固定液Carnoy固定剂配制方法：无水酒精：氯仿：冰醋酸（乙酸）按照体积比6：3：1的比例混合2）操作：3-1消化贴壁细胞，镜下观察，一般一个T25的瓶子可以铺一个6孔板的量3-2将盖玻片以镊子夹住一角，泡入酒精消毒后，火上烤几秒钟，冷却后放入6孔板中，要能差不多盖住孔的大部分面积为好3-3将细胞放入孔中分散，避免污染3-4待细胞贴壁长至60-70%盖片面积时（这个过程中可以根据试验设计，施加干扰因子或药物处理等。
具体时间由自己把握），即可倒掉培养液，取出盖片；3-5盖片用PBS或双蒸水轻轻洗涤（注意：洗涤片子时力度不要太大，避免细胞脱落，以下的处理同）几次以去掉残留的培养液，要注意细胞片的正反面，不要弄反了。
3-6 将细胞片浸入上述固定液（根据试剂情况选择合适的固定液，一般推荐Carnoy固定剂），固定时间15-20分钟即可3-7 取出细胞片，自然晾干，可以直接进行染色实验，接下述染色流程如不染色则按照下列流程处理保存细胞片3-8 将细胞片依次进入75%、80%、90%、95%、100%、100%酒精、二甲苯中各5分钟，取出3-9将细胞片用透明胶带贴附在载玻片上（细胞片的两端用透明胶固定贴好就可以了）3-10 放进冰箱冷冻室保存（-20度）。
一般可以保存10-15天时间，细胞不变形不溶解染色ICC二抗为福州迈新公司，KIT0305，浓缩型羊抗鼠/兔超敏SP试剂盒1）1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.2）洗涤切片3×5M；2）3%H2O2（以PBS缓冲液或甲醇配置）滴加在切片上，室温（18-30℃）静置10min；3）PBS洗2～3次各5min，故洗涤时动作不宜剧烈（以下相同）；4）滴加正常山羊血清封闭液,室温10-15min。
甩去多余液体。
5）滴加一抗50μL，置于湿盒内，4℃抗体孵育过夜或者37℃，1h，防止切片干燥。
免疫组化和免疫荧光的区别
请问你曾经被IHC、ICC和IF所困扰过吗？作者：北京义翘神州在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，先贴图上来以便有个大致的区分。
从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。
因此，才会延伸出三个相近的概念。
为了更好的区分这三个概念，我们还可以根据他们的英文词根来分析一下，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光 Immunofluorescence (IF)。
词根分析：Immuno-指的是免疫技术（例如，抗体和抗原的结合）Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质）Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质）Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化）Fluorescence-对被激发的荧光团的检测通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。
这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。
而常用的方法就是化学显色和荧光显色。
如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。
其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Immunofluorescence (IF)，但若是写成免疫组织荧光(IHF)或是免疫细胞荧光(ICF)，那我们是不是就豁然开朗了。
虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。
可能文字描述还是有些晦涩难懂，那我们就直接上图吧。
先不看下面答案，仅从几张图片，你能明白哪张图代表哪种应用吗？A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（10001-R043-50）—人胎盘B 免疫细胞化学：兔α微管蛋白单克隆抗体抗—MEF1细胞C免疫荧光组织：兔Cdk5单克隆抗体—鸡脑组织D免疫荧光细胞：兔JNK2/MAPK9（10745-R004-50）单克隆抗体—人Hela细胞A图和B图是免疫化学（Immunochemistry），这种应用是抗体检测目标蛋白，发生了化学反应，然后显色，根据样本类型的不同，又可以分为免疫组织化学（A）和免疫细胞化学（B）。
ICC-免疫细胞化学染色
ICC-免疫细胞化学染色
原代培养海马细胞神经元的鉴定
将大鼠海马神经元细胞终浓度（2*106个/ml）接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中，每孔2.5ml，培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定。
步骤如下：
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍，冷丙酮固定10min。
2.PBS冲洗3遍，3%H2O2（30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合）封闭内源性过氧化物酶，室温下10min。
3.PBS冲洗3遍，0.3%Triton破膜（溶解细胞膜，细胞核膜细胞器膜上的脂质）15min，PBS洗3遍。
4.10%羊血清封闭，室温10min，吸弃上清（不洗）。
一抗37℃反应1h（20μL的NSE+1ml稀释液），设空白对照，以PBS代替一抗
5.PBS洗3*5min，二抗（羊抗兔）室温下18min，PBS洗3*5min，SABC复合物37℃，18min。
（二抗标记的FITC在紫外光激发下显色）
6.PBS洗3*5min，DBA显色（5min）。
镜下观察，自来水终止。
DBA稀释度（1:50），苏木素复染（3min），95%乙醇脱水，二甲苯透明20min，中性树胶封固，风干，镜下观察。
注：PBS用0.01M的（配置成0.1M的，用时稀释）。
免疫细胞化学
免疫细胞化学（immunocytochemistry）是将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
肽类与蛋白质种类繁多，均具有抗原性，当将人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物体内，则产生与该抗原相应的特异性抗体（免疫球蛋白）；将抗体从血清中提出后，结合上某种标记物，即成为标记抗体。
用标记抗体与组织切片标本孵育，抗体则与细胞中相应抗原发生特异性结合，结合部位被标记物显示，则在显微镜下观察到该肽或蛋白质的分布。
用荧光素（常用异硫氰酸）标记抗体，并于荧光显微镜下观察，称免疫荧光术。
如抗体与辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）等结合，进行酶显示后，可在光镜或电镜观察，用于电镜者则称为免疫电镜术（immunoelectronmicroscopy)此外，以铁蛋标记抗体白标记抗体，称铁蛋白标记法,也能用于电镜下观察。
标记抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法：用标记抗体与抗体中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原；②间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物。
通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为广泛。
间接法中较常用的，如过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase anti-peroxidase complexmethod，标记方法PAP法)，该法除需一抗和二抗外，还需要制备HRP标记的抗酶抗体,即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP对标记该抗体，制成稳定的环形PAP复合物。
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第一章：抗体和抗体的结构 .................................................. 3 第二章：抗体纯化 ................................................................ 6 第三章：抗体选择和稀释 ..................................................... 7 第四章：荧光 ....................................................................... 9 4.1 荧光染色-工作原理 ........................................................ 9 4.2 荧光染料表 ................................................................... 11 第五章：蛋白质免疫印迹技术 ............................................ 13
ABCAM 免疫荧光说明书
Immunocytochemistry (ICC) and immuofluorescence (IF)General procedure1. Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature.2. Rinse coverslips well with sterile H2O (three times 5 min each).3. Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hr.4. Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation.5. Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS).6. For wash buffer we recommend 1x PBS 0.1% Tween 20.FixationThe cells may be fixed using one of two methods:1. Incubating the cells in 100% methanol (chilled at -20°C) at room temperature for 5 min.2. Using 4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 10 min at room temperatureThe cells should be washed three times with ice cold PBS.Antigen retrieval (optional step)Certain antibodies work best when cells are heated in antigen retrieval buffer. Please check theproduct datasheets for recommendations for each primary antibody being used.1. Preheat the antigen retrieval buffer (100 mM Tris, 5% (w/v) urea, pH 9.5) to 95°C. This can be done byheating the buffer in a coverglass staining jar which is placed in a water bath at 95°C.2. Using a small pair of broad-tipped forceps, place the coverslips carefully in the antigen retrieval buffer inthe cover glass staining jar, making note of which side of the coverslips the cells are on.3. Heat the coverslips at 95°C for 10 min.4. Remove the coverslips from the antigen retrieval buffer and immerse them, with the side containing the cellsfacing up, in PBS, in the 6-well tissue culture plates.5. Wash cells in PBS three times for 5 min.PermeabilizationIf the target protein is localized intracellularly, it is very important to permeabilize the cells.Acetone fixed samples do not require permeabilization.1. Incubate the samples for 10 min with PBS containing either 0.1 - 0.25% Triton X-100 (or 100 μM Digitonin or0.5% Saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody.However, it is not appropriate for membrane-associated antigens since it destroys membranes.The optimal percentage of Triton X-100 should be determined for each protein of interest.2. Wash cells in PBS three times for 5 min.Blocking and Immunostaining1. Incubate cells with 1% BSA in PBST, 22.52 mg/ml glycine in PBST (PBS+ 0.1% Tween 20) - for 30 min toblock unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species from which the secondary antibody was raised in. Please see antibody datasheet forrecommended blocking).2. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at roomtemperature or overnight at 4°C.3. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash.4. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in the dark.5. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in the dark. Multicolor Immunostaining (optional step)In order to examine the co-distribution of two (or more) different antigens in the same sample, a double immunofluorescence procedure can be carried out. This can be performed either simultaneously (in a mixture) or sequentially (one antigen after another).Please ensure you have antibodies for different species and their corresponding secondary antibodies. For example, rabbit antibody against antigen A, mouse antibody against antigen B. Alternatively, you can use directly conjugated primary antibodies conjugated to different fluorophores.Simultaneous incubation1. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternativeblocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species that the secondary antibody was raised in).2. Incubate cells in the mixture of two primary antibodies (e.g. rabbit against human target-1 and mouseagainst human target-2, if the targets are human proteins) in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C.3. Decant the mixture solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash.4. Incubate cells with the mixture of two secondary antibodies which are raised in different species (with twodifferent fluorochromes, i.e. Texas Red-conjugated against rabbit and FITC-conjugated against mouse) in 1% BSA for 1 hr at room temperature in the dark.5. Decant the mixture of the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in thedark.Sequential incubation1. First blocking step: incubate cells with the first blocking solution (10% serum from the species that thesecondary antibody was raised in) for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 1% BSA) at room temperature.2. Incubate cells with the first primary antibody in 1% BSA or 1% serum in PBST in a humidified chamber for 1hr at room temperature or overnight at 4°C depending on the concentration of the antibody and theaccessibility of the antigen.3. Decant the first primary antibody solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash.4. Incubate cells with first secondary antibody (labelled with Fluorochrome-1) in 1% BSA in PBST for 1 hr atroom temperature in the dark.5. Decant the first secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in the dark.6. Second blocking step: incubate cells with the second serum (10% serum from the species that thesecondary antibody was raised in) for 30 min at room temperature to block unspecific binding of theantibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 1% BSA) in the dark.7. Incubate cells with the second primary antibody in 1% BSA or 1% serum in PBST in a humidified chamber inthe dark for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C depending on the concentration of the antibody and the accessibility of the antigen.8. Decant the second primary antibody solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash in thedark.9. Incubate cells with second secondary antibody (labelled with Fluorochrome-2) in 1% BSA for 1 hr at roomtemperature in the dark.10. Decant the second secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in the dark. If you have to detect more than two antigens, continue following steps 1-5 for the rest of the antibodies. Counter staining1. Incubate cells on 0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min.2. Rinse with PBS.Mounting1. Mount coverslip with a drop of mounting medium.2. Seal coverslip with nail polish to prevent drying and movement under microscope.3. Store in dark at -20°C or +4°C.。
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
免疫组织化学技术
化合物酶复合物（EnVision复合物），与第一抗体结合，进而由酶 作用底物进行显色定位。
荧光免疫组织染色方法
• 使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组
织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵 敏度高、操作简单的优点。
• 缺点是染色组织片不能长期保存
IF常用荧光素
• • •
• •
FITC：绿色，激发波长488nm；发射波长515nm Rhodamine：橙色，激发波长570nm；发射波长570590nm
免疫组化基本操作步骤 及需要的试剂
免疫组化基本操作步骤
Envision二步法操作步骤
• • • • • • • • • • • • • • • • •
1、组织切片60℃预热 2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水） 3、抗原修复 4、PBS/T洗3次，5min/次 5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP） 6、PBS/T洗3次，5min/次 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R） 8、一抗4 ℃孵育过夜 9、PBS/T洗3次，5min/次 10、二抗RT 30min 11、PBS/T洗3次，5min/次 12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度 13、充分水洗 14、苏木素复染核 15、1%盐酸酒精分化 16、充分水洗返蓝 17、脱水、透明，中性树胶封片
免疫荧光（细胞标本）
免疫组织化学 (石蜡切片) 免疫组织化学 (冰冻切片) 免疫荧光 免疫组织化学 免疫组织化学 (甲醇固定) 免疫组织化学 (PFA 固定标本)
IHC-FoFr
IHC-FrFl IHC-G IHC-Glut IHC-M
免疫组织化学 (灌注固定冰冻切片)
免疫组织化学 - Free Floating 免疫组织化学 (Glycolmethacrylate sections) 免疫组织化学 (PFA-glutharaldehyde fixed) 免疫组织化学 (Methylmethacrylate sections)
免疫细胞化学方法对照设置
免疫细胞化学方法对照设置王文泽;梁智勇;崔全才【摘要】利用抗体为媒介显示培养细胞或组织切片中的局部结构是一种十分有用的方法,已经成功地应用于很多重要的发现之中,包括基于同一原理的免疫细胞化学、免疫组织化学以及免疫荧光在内的多种具体方法.本文泛指基于抗原抗体结合反应多种方法统称的免疫细胞化学(immunocytochemistry,IHC).IHC 方法被广泛应用于科学研究中,并有很高的科研产出,在PubMed进行相应词条检索,列出的科研文章多达50万篇,而其结果的可靠性也成为一个重要的科研命题.【期刊名称】《协和医学杂志》【年(卷),期】2012(003)001【总页数】4页(P120-123)【关键词】免疫细胞化学;质控;对照;免疫染色;免疫荧光【作者】王文泽;梁智勇;崔全才【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科,北京100730【正文语种】中文【中图分类】R-331利用抗体为媒介显示培养细胞或组织切片中的局部结构是一种十分有用的方法，已经成功地应用于很多重要的发现之中，包括基于同一原理的免疫细胞化学、免疫组织化学以及免疫荧光在内的多种具体方法。
本文泛指基于抗原抗体结合反应多种方法统称的免疫细胞化学 (immunocytochemistry，IHC)。
IHC方法被广泛应用于科学研究中，并有很高的科研产出，在PubMed进行相应词条检索，列出的科研文章多达50万篇，而其结果的可靠性也成为一个重要的科研命题。
随着抗原热修复方法的引入，IHC方法越来越多地应用于日常临床病理诊断中，并成为形态学诊断必不可少的辅助手段。
随着个体化医疗和肿瘤靶向治疗的发展，越来越要求对IHC方法进行量化，从而越来越要求对其实验过程实行标准化［1-2］。
这就需要设置一系列的对照确认整个反应各方面的准确性，以保证最终结果的可信性。
免疫细胞化学在胸腹水肿瘤细胞学诊断中的应用
免疫细胞化学在胸腹水肿瘤细胞学诊断中的应用石龙姣【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2013(026)006【摘要】目的:探讨免疫细胞化学(ICC,immunocytochemistry)方法诊断胸腹水中细胞的良恶性和鉴别诊断恶性肿瘤细胞的组织学类型的临床意义.方法:对临床送检的胸腹水标本,除进行HE染色常规细胞学涂片和液基薄层细胞片(TCT)检查外,还将胸腹水制成石蜡包埋细胞块(CB,cell block),进行石蜡包埋细胞块的免疫细胞化学染色(CBICC),诊断细胞的良恶性,确定肿瘤细胞的组织起源.结果:186例患者,胸腹水细胞经免疫细胞化学鉴别诊断出:良性病变52例；恶性肿瘤134例,其中乳腺癌24例,肺癌27例,甲状腺癌18例,胃肠道癌22例,卵巢癌19例,肝癌9例,前列腺癌7例和间皮肉瘤8例,恶性肿瘤均经组织病理学证实.结论:病理细胞块的免疫细胞化学确定胸腹水中细胞的良恶性和鉴别诊断恶性肿瘤细胞的组织起源特异性强、敏感性高,具有客观、准确的特点,有着广泛的临床应用价值和推广前景.【总页数】3页(P721-723)【作者】石龙姣【作者单位】安徽理工大学医学院,安徽省淮南市232001;徐州医学院第二附属医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R730.4【相关文献】1.用免疫细胞化学鉴别胸腹水脱落细胞在肿瘤诊断中的价值 [J], 杨江辉;余琦;周会芹;李宁2.免疫细胞化学技术在胸腹水脱落细胞学诊断中的应用 [J], 何秋香;朱启建;陈建欧;万丽;王群姬;黄卡特3.用免疫细胞化学鉴别胸腹水脱落细胞在肿瘤诊断中的价值 [J], 杨峰4.免疫细胞化学在胸腹水细胞学诊断中的应用 [J], 王雅如;柳志向5.自配液基保存液在免疫细胞化学染色辅助细胞学诊断肺癌中的应用 [J], 韦荣干;叶秋容;周敏燕;黎莉;黄佳珍;韦黎黎;莫祥兰;黄谟婉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC)
General Procedure:
i Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature.
ii Rinse coverslips well with sterile H2O (3 times 5 min each).
iii Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hrs.
iv Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation.
v Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS).
Fixation:
1. Fix the samples either in ice-cold methanol, acetone (1-10 min) or in 3-4% paraformaldehyde in PBS
pH 7.4 for 15 min at room temperature.
2. Wash the samples twice with ice cold PBS.
Permeabilization:
If the target protein is expressed intracellularly, it is very important to permeabilize the cells. Note: acetone fixed samples do not require permeabilization.
3. Incubate the samples for 10 min with PBS containing 0.25% Triton X-100 (or 100 µM digitonin or 0.5% saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate for the use of membrane-associated antigens since it destroys membranes.
4. Wash cells in PBS three times for 5 min.
Blocking and Incubation:
5. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species that the secondary antibody was raised in).
6. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C.
7. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash.
8. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in dark.
9. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in dark.
Counter staining:
10. Incubate cells on 0.1-1 µg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min.
11. Rinse with PBS.
Mounting:
12. Mount coverslip with a drop of mounting medium.
13. Seal coverslip with nail polish to prevent drying and movement under microscope.
14. Store in dark at -20 or 4°C.。