第四章 克隆载体的特征及类型

第二节 Biblioteka Baidu粒
质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并 被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型
质粒常见于原核细菌和真菌中
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环 (ocDNA)和线性(lDNA)构型。 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构， 即cccDNA Plasmid chromosome
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
Cop
Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
质粒
质粒的基本特征
2. 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
利用 抗性 基因 进行 重组 子的 筛选
质粒基因编码的特性
Fertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移 外没有其他功能。 Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因 。如RP4，发现于假单胞杆菌。 Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存 在于E. coli 中的CoE1。 降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分 子如：甲苯，水杨酸。 致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。
拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
lacZ'
pUC18
2686 bp Apr
ori
pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基 因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ 基因内的一个小片段上。 pUC18的优点： 1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。 2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。 3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不 必连接linker。 4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插 入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和 体外定点突变。
质粒
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性 由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒
质粒的基本特征
5. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
pBR322 4363 bp
Sal I
Bal I
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA， amp基因内可被 Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基 因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
质粒
质粒的基本特征
3. 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和 mob 基因决定
理想的质粒载体应具备的条件
1. 2. 3.
分子量较小。 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有 一个强的选择标记。 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区 内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质 粒载体。
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z： 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子 用于外源基因的高效表达
ori Apr pGEM-3E 2743 bp lacZ’ PT7 MCS PSP6
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
质粒
质粒的分类
人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因 温敏质粒 测序质粒 整合质粒 穿梭质粒 表达质粒 探针质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选
质粒
质粒的基本特征
1. 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop （+） ） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
4.
5. 6.
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 因而不适合用作基因工程的载体， 因而不适合用作基因工程的载体 须对之进行改造构建： 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 ）加入合适的选择标记基因，如两个以上， （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 ）增加或减少合适的酶切位点， （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 ）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率， （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 ）改变复制子，变严紧为松弛， （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 ） 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。
在重组的 pGEM3Z载体中 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 加入相应的RNA 聚合酶， 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。 转录。
质粒载体总体评价
操作简便 克隆容量有限（< 10kb）
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
Plac pUC18/19 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷 X-gal
CH2OH O HO H O OH H H H H OH N
MCS
lacZ’
β
Cl Br
α
β-半乳糖苷酶的α-肽段
Cl Br N Cl O N Br
第一节 载体的功能及特征
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制； 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； 具有筛选转化子的选择性标记基因； 分子量小，拷贝数多； 具有较高的外源DNA的载装能力； 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细 胞以外的其它生物细胞中。
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒
质粒的构建 天然存在的两种质粒 宿主细菌大肠杆菌， 20colE1宿主细菌大肠杆菌 6.5kb，松弛型复制20 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制2030/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell 宿主细菌沙门氏菌 ，标记基因为Tcr 标记基因为Tc
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pBR322： 松弛型复制 拷贝数 50 - 100 / cell 氯霉素可扩增 用于基因克隆
ROI ROP Origin of Replication Hind II Pvu I Pst I Apr Tcr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I
自主复制型载体和附加载体的扩增方式
载体的类型
应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物） 、穿梭载体。 构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与 病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片 段组成的载体。
克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。 一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复 制子。
表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可 将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的 基因能够复制、转录和翻译。
穿梭载体(shuttle vector)
又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点 或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在 真核细胞中复制和表达。 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体 和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞 中表达，并可提高外源基因的表达效率。
第四章 基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 粘粒（cosmid）与噬菌粒 人工染色体载体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自 我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表 达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。
Tet平板 Tet平板
Amp Tet 插入片段
pBR322
Amp平板 Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452