荧光分析法
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荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法ppt
当分子从激发态返回到基态时，会以释放光子的形式释放出多余的能 量，这种释放的光子就是荧光。
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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THANKS
详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法
关系：
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
第十一章 荧光分析方法
5
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
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激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
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（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
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5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
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光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
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② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
荧光分析法
第二节 基本原理
一、荧光与磷光的产生过程 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
1.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应 单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光测量波长(选最大发射波长),测定得到的化合物 发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
2020/6/12
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选
最大激发波长),测定得 到的化合物发射的荧光(
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的 几率小；
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
2Hale Waihona Puke 分子能级与跃迁：分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：
吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
2020/6/12 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
第一节 概述
一、什么是荧光？ 当某物质吸收特定波长的光之后，除产
分析化学第11章--荧光分析法
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
荧光分析法
四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与 荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。
影响荧光强度的主要因素
是波长比入射光较 长的拉曼散射光。因为物质发射的荧光波长比 激发光（即入射光）波长长。
• 消除溶剂拉曼光干扰的方法： - 选择合适的溶剂
- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动 如硫酸奎宁的测定
1.荧光检测的基本原理
14
2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图 ，便可得到荧光物质的荧光光谱。
（四）、影响荧光强度的外部因素
温度
溶剂
酸度
01
02
03
荧光熄 灭剂
散射光
04
05
1. 温度的影响
• 随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在 0℃以下，每降10℃荧光效率增加3％。-80 ℃ 时达到100％。
• 原因是温度升高，分子运动速度加快， 碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因 而降低了荧光；
常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长
激发光 波长 248 水 271 溶剂拉曼光波长 乙醇 环己烷 267 四氯化碳 － 氯仿 －
267
313
365 405 436
350
416 469 511
344
405 459 500
344
408 458 499
《荧光分析法》课件
通过改进技术手段，实现多组分的同步检 测，提高检测效率。
微型化与便携化
智能化与自动化
随着技术的进步，荧光分析仪器将更加微 型化和便携化，方便现场快速检测。
结合人工智能和自动化技术，实现荧光分 析的智能化和自动化，减少人为误差和操 作复杂度。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
成和含量。
荧光分析法的应用领域
环境监测
荧光分析法可以用于检测水体 、土壤和空气中的污染物，如
重金属、有机物和农药等。
生物医学研究
荧光分析法可以用于检测生物 体内的标记物、蛋白质、核酸 和细胞等，有助于生物医学研 究和诊断。
食品安全检测
荧光分析法可以用于检测食品 中的添加剂、农药残留和有害 物质等，保障食品安全。
高特异性
荧光分析法可以针对特定的化学物质 或生物分子，提供高度特异性的检测， 降低误报率。
可视化结果
荧光分析法的结果可以通过肉眼直接 观察或使用荧光显微镜进行观察，方 便快捷。
应用广泛
荧光分析法可以应用于多种领域，如 生物医学、环境监测、食品安全等。
荧光分析法的缺点
01
02
03
04
样品处理复杂
荧光分析法通常需要对待测样 品进行预处理，如提取、纯化
荧光寿命的测量
通过测量荧光物质在激发光停止后荧光强度随时间的变化，可以了解荧光物质从 激发态回到基态的速率常数和荧光寿命。
时间分辨荧光光谱的测量
通过测量不同时间点的荧光光谱，可以了解荧光物质在激发态的动态过程和能量 转移过程。
荧光量子产率的实验技术
荧光量子产率的测量
通过测量荧光物质在特定波长激发下的荧光发射光子数和激发光子数，可以计算出荧光量子产率，了 解荧光物质的光致发光效率。
第12章 荧光分析法
荧光猝灭剂：引起荧光熄灭的物质。 荧光猝灭剂：引起荧光熄灭的物质。
例：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、羰基等 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、
自吸收现象： 自吸收现象：荧光物质发出的荧光被荧光物质的 基态吸收or激发态分子之间的碰撞 激发态分子之间的碰撞， 基态吸收or激发态分子之间的碰撞， 导致非辐射跃迁概率增大， 导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率 降低。 降低。 增大荧光物质的浓度， 增大荧光物质的浓度，会产生荧光自熄灭现 浓度越大，此现象越严重。 象，浓度越大，此现象越严重。
化学发光：由化学反应提供激发能， 化学发光：由化学反应提供激发能，激发 产物分子或其他共存分子产生的光辐射。 产物分子或其他共存分子产生的光辐射。 化学发光与荧光、 化学发光与荧光、磷光的区别是激发能不 而它们的光谱十分相似。 同，而它们的光谱十分相似。 化学发光特点：灵敏度高， 化学发光特点：灵敏度高，对气体和痕量 金属离子的检出限可达ng/ml 金属离子的检出限可达
磷光发射： 磷光发射：分子由三线态返回到基态的各个振动能 级而发出光辐射。 级而发出光辐射。 激发三线态的最低振动能级比激发单线态的 最低振动能级能量低， 最低振动能级能量低，磷光辐射的能量比荧光更 磷光的波长长于荧光。 小，磷光的波长长于荧光。 激发三重态的平均寿命为10 s，因此， 激发三重态的平均寿命为10-4～10 s，因此，磷光 在光照停止后仍可维持一段时间。 在光照停止后仍可维持一段时间。
荧光与分子结构的关系
-O O C COOO
（1）
荧光黄
苯并芘
共轭双键体系越大, 共轭双键体系越大,越易产生荧光
刚性平面结构有利于荧光的产生； *刚性平面结构有利于荧光的产生； *有机配位剂与金属离子形成合物后荧光 强度大大增强。 强度大大增强。 *给电子取代基（如－OH、－ 2、－ 、 、－NH 、－OR、 给电子取代基（ 、－ 使共轭体系增大，荧光增强； －NR2等 ）使共轭体系增大，荧光增强； （－NO 、－COOH、C＝O、 吸电子取代基（－ 2、－ 、 ＝ 、 卤素离子等），荧光减弱。 ），荧光减弱 卤素离子等），荧光减弱。
第十四章荧光分析法
如果标准曲线通过零点，可用比例法进行 测定。配制一标准溶液，使其浓度在线性范 围内，测定荧光强度FS，然后在同样条件下 测定试样溶液的荧光强度FX。由标准溶液的 浓度CS和两种溶液的荧光强度比，求得试样 中荧光物质的浓度CX或含量。
3．解线性方程法
多组分混合物的荧光分析也可以象 吸收分光光度法一样利用荧光强度 的加和性质，采用解线性方程组的 方法、双波长及多波长等方法从混 合物中不经分离即可测得被测组分 的含量。
ln F0 t
Ft f
二、荧光强度与分子结构的关系
一个化合物能否产生荧光，荧光强度的大小， λex(max)和λem(max)的波长位置均与其分子 结构有关。下面简述影响分子荧光强弱的一 些结构规律。
(一) 跃迁类型 (二) 共轭效应
(三)刚性结构和共平面效应 (四) 取代基效应
三、影响荧光强度的外界因素
4．体系间跨越(intersystem crossing)
又称体系间交叉跃迁，指不同多线态间的无 辐射跃迁。如内转换一样，若两电子能态的 振动能级重迭，将会使这一跃迁几率增大。 图14-2中S→ T的跃迁即为体系间跨越。激发 单线态的最低振动能级同三线态的较高振动 能级重迭，因而发生电子自旋状态改变的体 系间跨越就有了较大的可能性。
分子所处的外界环境，如溶剂、温度、pH、 重原子、荧光熄灭剂等都会影响荧光效率， 甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧 光光谱和荧光强度。
(一) 溶剂的影响 (四) 氢键的影响 (二) 温度的影响 (五) 散射光的影响 (三) pH值的影响
(六)荧光熄灭剂(quenching medium) 的影响
1．直接荧光法 2．荧光衍生物法 3．化学引导荧光法 4．荧光熄灭法 5．胶束增敏荧光分析法
荧光分析法
F
λem 单色器 λex 固定 λem
改变
检测器
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λ
21
荧光光谱具有以下特征： （1）荧光光谱的形状与激发波长无关
荧光发射通常发生于第一电子激发态的 最低振动能级，与激发至哪一个电子激发 态无关，所以荧光光谱的形态通常与激发 波长无关。
荧光光谱只有一个发射带
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（2）荧光光谱与激发光谱呈镜像关系
第二激发态
第一激发态
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电子能级
振动能级
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特点：荧光的能量小于激发光能量。 荧光发射所需时间为10-9~10-7s。
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10
（4）外部能量的转移
激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间 相互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。
常发生在第一激发单线态或第一激发三线态 的最低振动能级向基态转换的过程中
（6）磷光：经过体系间跨越的分子降至三线 态最低能级，跃迁至基态而发生的光。
电子能级
振动能级
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特点：（1）λ（磷光）>λ（荧光） （2）寿命10-4—10s （3）室温下溶液很少呈现磷光（需冷冻）
处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换 ④ 外部能量转换
外部能量转换可降低荧光强度，有时也称为 荧光猝灭或荧光熄灭。
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11
（5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，其多重性发
生变化（激发单线态—激发三线态）
发生条件：物质中含有重原子如Br、I等
电子能级
振动能级
分子由激发单线态跨越到三线态后，荧光强度减弱
甚至熄灭。
荧光分析法基本概念
荧光分析法基本概念荧光分析法是一种基于物质发射和吸收荧光现象的分析技术。
荧光是指物质吸收电磁辐射后，经激发而发出的光辐射。
荧光分析法利用物质在激发射线的激发下产生的荧光进行定性和定量分析。
它具有高灵敏度、高选择性和高准确性等优点，广泛应用于化学、生物、医学、环境等领域。
荧光原理：荧光原理是指物质在吸收电磁波能量后，部分或全部转化为光能并发出荧光。
荧光的激发和发射有两种机制：分子吸收电磁辐射后跃迁到激发态，然后再从激发态返回基态释放能量发光；分子之间发生能量传递，从激发的分子接收能量并转化为荧光发射。
荧光分析原理：荧光分析技术基于物质的荧光性质。
荧光分析法通过测量物质在特定激发光激发下产生的荧光强度或荧光寿命，来获取物质的信息。
荧光分析法包括荧光光谱分析和荧光寿命分析。
荧光光谱分析：荧光光谱分析是指根据物质在激发下发射的荧光光谱特性来进行定性和定量分析。
荧光光谱是物质荧光发射的光波长与相应的荧光强度之间的关系。
通常，物质的荧光光谱有较为特征的波长范围和特定的峰。
荧光寿命分析：荧光寿命是指物质从激发态到基态的转变所需的平均时间，也称为物质的荧光衰减曲线。
荧光寿命分析利用物质的荧光寿命来进行定性和定量分析，可以通过测量荧光寿命来确定物质的存在和浓度等信息。
常见的荧光分析方法有荧光光谱仪、荧光显微镜、荧光染料、荧光标记等。
荧光光谱仪是荧光分析的重要工具，可以测量物质的荧光光谱，并通过荧光光谱来判断物质的性质和含量。
荧光显微镜是利用物质的荧光特性来观察样品的工具。
荧光染料是一种通过吸收和发射荧光的物质，常用于生物分子的标记和显色。
荧光标记是一种将荧光染料或荧光物质与分析物相结合，通过测量标记物的荧光特性来进行定性和定量分析。
荧光分析法在化学、生物、医学和环境等领域有广泛应用。
在化学分析中，荧光分析法可以用于分析确定荧光染料的结构、测定荧光染料的含量和纯度等。
在生物和医学领域，荧光分析法可以用于检测和定量分析蛋白质、核酸、细胞和微生物等生物分子和生物体。
荧光分析法2.
⒊荧光光谱的形状与激发波长无关 用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观
察到形状相同的荧光发射光谱。 这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发
态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过 程后最终回到第一激发态的最低振动能级。而分 子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级 跃迁到基态的各振动能级上。
五、影响荧光强度的因素
㈡发光分子所处的环境 荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影
响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏 度和选择性。
㈠分子结构
⑴跃迁类型：
大多数荧光化合物多是由π→π＊或n→π＊跃 迁所致的激发态去活后，发生π＊→π或π＊→n 跃迁产生的。
π＊→π跃迁的量子效率高，是由于π→π＊ 跃迁的摩尔吸光系数比n→π＊跃迁大100～1000 倍,跃迁的寿命(10-7 ～10-9s)又比n→π＊(10-5 ～
荧光的去激发过程：
①发射荧光返回基态(强的荧光物）
②无辐射跃迁回到基态(低荧光物质)
三、荧光的激发光谱和发射光谱
任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激 发光谱和荧光光谱。 ⒈荧光激发光谱
激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波
长而获得的荧光强度(F)—激发波长(λex)的关系
曲线。 激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，
一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧 光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。
因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于 提高分析的灵敏度。
⑶pH的影响
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
不同激发波长激发的荧光的相对效率。 激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
44
4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
第十二章荧光分析法(Fluorometry)
kF
+ kVR
+ kIC
kF + kISC
+ kEC
+ kP
❖ 凡使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素 均可增加荧光量子产率。
❖ kF通常由分子结构决定，而其它参数则由化学
环境和结构共同决定。
2020年7月11日星期六
16
※ 3、荧光产生的条件
❖ 产生并可观察到荧光的条件： 1）分子必须具有吸收一定频率紫外光的特定 结构； 2）物质吸收特征频率的辐射后，必须具有较 高的荧光效率
13
2020年7月11日星期六
14
二、荧光与分子结构的关系
1、荧光寿命：
❖ 去除激发光源后，分子荧光强度降低到最大荧光强度 的1/e所需的时间，用τf 表示。
❖ 根据指数衰减定律可求出荧光寿命：
Ft = F0e－Kt
若t = τ f ,则Ft = ( 1 / e )F0 ,K = 1 / τ f
2020年7月11日星期六
6
（3）外转换（External Conversion，EC）
❖ 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使 荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或 “猝灭”。常发生在第一激发单重态或激发三重态的最 低振动能级向基态转换的过程中。
（4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）
基态：M=2S+1=1
激发态： S=0，M=2S+1=1 S=1，M=2S+1=3
S*1
T*1
2020年7月11日星期六
4
荧光和磷光产生示意图
2020年7月11日星期六
5
2. 去活化过程（Deactivation）
荧光分析法
荧光 分子光谱 发射光谱 10-8~10-10g/ml
高
可见紫外 分子光谱 吸收光谱 10-5~10-7g/ml
一般
返回
11.2 根本原理
11.2.1 分子荧光光谱的产生 11.2.2 激发光谱与发射光谱 11.2.3 分子构造与荧光的关系 11.2.4 影响荧光强度的外部因素
11.2.1 分子荧光光谱的产生
荧光强度F，以F-λex作图得荧光物质的激发光谱。 发射光谱：〔荧光光谱〕固定激发光波长λex，依次改变发射
波长λem，测荧光强度F，以F-λem作图得荧光光谱。
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的根据
1. 荧光光谱的特点〔重点〕
〔1〕斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。 原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换
续前
〔3〕荧光光电计与荧光分光光度计的比较
激发光源 激发单色器 发射单色器
检测器
样品池
光电荧光计 荧光分光光度计
汞灯
氙灯
第一滤光片
光栅
第二滤光片
光栅
光电倍增管
石英、玻璃池（低荧光的玻璃）
返回
小结： 掌握
根本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、 外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱 与荧光光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光〔谱二：〕〔与激吸发收光光谱谱类与似荧〕表光示光不谱同激发波长的辐射引起
物质发射某一波长荧光所得的光谱。 方法：固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex，测
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
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影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
极性溶液中→ * 跃迁能量差减小，跃迁几率增加，紫 外吸收和荧光均长移，且强度增加。
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子间碰撞几率 增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。
3. 溶液 pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，主要是影响了其电 离。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。 外转换 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移 能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越 不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
❖ 辐射能量传递过程
2020/4/29
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的 波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量， 产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动 能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形 状一样）成镜像对称关系。
以激发波长为横坐标，荧光或磷光发光强度为纵 坐标的光谱。激发光谱曲线的最高处，处于激发态 的分子最多，荧光强度最大
2. 发射光谱
以荧光或磷光的发射波长为横坐标，发光强度为 纵坐标的光谱
2020/4/29
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
荧光分析法
2020/4/29
基本概念 基本原理
1 分子结构与荧光 2 荧光强度的影响因素 3 荧光定量分析 荧光分光光度计
基本概念
荧光（ fluorescence ） 磷光（ phosphorescence ） 振动弛豫（vibrational relaxation） 内部能量转换（internal conversion） 体系间跨越 激发光谱 荧光光谱
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
激发光谱与荧光(磷光)光谱
excitation spectrum and fluorescence （ phosphorescence ） spectrum
1. 激发光谱
2020/4/29
练习
在测定分子荧光强度时，要在与入射光 成直角的方向上进行测量，这是由于___ （1998）
A 荧光强度比透射光强度小 B 只有在入射光成直角的方向上才荧光 C 荧光是向各个方向发射的，为了避免透
射光的影响
2020/4/29
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
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l 2 l 2
❖非辐射能量传递过程
振动弛豫 同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至 低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换 同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。
2020/4/29
荧光效率（fluorescence efficiency） 荧光量子产率（quantum yield）
荧光熄灭 共振荧光 与 迟滞荧光 荧光寿命
2020/4/29
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低
2020/4/29
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系 间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的 产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧 光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：分子刚性平面越大， 荧光效率越大，且荧光波长长移（顺反异 构体） （4）取代基效应：芳环上有供电基，能增 加电子共轭程度，使荧光增强。
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
比例法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较
2020/4/29
仪器结构
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 单色器：选择激发光波长的第 一单色器和选择发射光(测量) 波长的第二单色器； 光源：灯和高压汞灯，染料激 光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
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荧光与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关， 如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2020/4/29
2.化合物的结构与荧光
2020/4/29
4. 荧光熄灭剂的影响 如卤素离子，重金属离子，氧分子，硝基化
合物，重氮化合物，羰基羧基化合物 5 散射光的干扰
瑞利散射和拉曼散射
2020/4/29
定量分析
定量依据：低浓度时，溶液荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = KC
定量方法：
标准曲线法 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制 标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在 标准曲线上求出浓度