组织与细胞化学考试重点

1.异染现象：染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。

2.自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光。

3.诱发荧光：细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始可呈现一定颜色的荧光，称为诱发荧光。

4.点计数：计数落于所测图像（轮廓面）内的测点数。

5.交叉点计数：计数侧线与所测图像的周界线之间形成的交叉点的数目。

6.DAB：是3，3ˊ-二氨基联苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。

7.形态计量术(morphometry)：是运用数学和统计学原理对组织和细胞内各种成分的数量、体积、表面积等的相对值与绝对值的测量。

8.各向同性：是指特征物在各个方向上都分布均匀的特性。

9.各向异性：是指特征物在各个方向上分布不均匀的特性。

10.饲养细胞：在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其他活的细胞才能使其生长繁殖，加人的细胞称为饲养细胞(feeder cell)。

11.不完全抗原：只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。

12.生物素标记法：将生物素用酶学方法或化学方法连接在核酸探针上，分子杂交后利用抗生物素对生物素具有高度亲和力的特性，用标记的生物素蛋白或链酶抗生素蛋白进行检测。

13.灰度：是指一个像素色泽的深浅，它以整数值的形式表示，可表示为K=0,1,2…K个级别，称量化级别。

灰度值越小，表示染色深度越强，物质含量越高。

14.特征物：就是指要定量研究的形态结构，即感兴趣的某种组织结构，它具有一定的形状和分界，在肉眼或显微镜下可以识别或分辨。

15.荧光免疫组化：采用荧光素标记已知抗体，在适合的情况下，与组织细胞中的靶抗原（或抗体）反应，可在荧光显微镜下观察结果。

16.原位杂交组化：是应用已知碱基顺序并带有标记物核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。

二、简答题1、试述荧光显微镜的原理、结构及生物学应用答：①原理：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素A呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色～金黄色荧光。

但是,细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始可呈现一定颜色的荧光；如应吖啶橙（荧光素）处理细胞后，细胞核内的DNA 呈绿～黄绿色荧光，细胞质及核仁内的RNA呈桔黄～桔红色荧光。

②结构：它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列滤片装置的显微镜。

③应用：是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。

利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织、细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。

或用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学研究。

2、免疫组织化学中如何进行抗原修复，其方法有哪些？答：①蛋白酶消化：a、胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37℃、10～40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

b、胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示。

②抗原热修复：可根据实验室的具有条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原。

（例：石蜡切片微波炉抗原修复的具体步骤）3、酶组织化学的方法通常有哪些，注意事项，举例说明细胞色素氧化酶的原理。

（不全）答：免疫酶组织化学法是抗原抗体的特异性与酶的高效催化作用相结合的一种免疫标记法。

通过用酶标记抗原或抗体的示踪，对呈色反应后的有色化合物进行分光光密度的测定，可对免疫阳性产物做半定量的分析。

①标记酶法：1)辣根过氧化物酶（HRP）易获得,分子小,易穿透到细胞内；2)碱性磷酸酶(ALP)；3)葡萄糖氧化酶②非标记抗体免疫酶法：1）PAP法；2)双桥PAP法；3)APAAP法③亲和免疫组织化学技术④放射自显影标记法⑤胶体金法酶组织化学技术的注意事项：①选择最适温度、ph值及缓冲液；②为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长；③有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂；④进行对照试验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照。

细胞色素氧化酶显示法的原理：细胞色素氧化酶被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞内都具有高度活性。

此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。

细胞色素氧化酶的抑制剂是氰化物和叠氮化物。

此酶对固定剂敏感，故需使用新鲜切片。

本实验用N-苯基-对-苯二胺为底物，在有氧存在的情况下，经酶作用可与萘酚生成靛酚，称为Nadi反应。

4、什么是单克隆抗体与多克隆抗体，试比较它们的优缺点。

答：①由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称为单克隆抗体，具有特异性强、纯度高的特点。

②将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体。

③比较:单克隆抗体结构均一，纯度高，特异性强、效价高，而且一旦制备成功就可以永续生产完全一致的抗体。

多克隆抗体在特异性方面无法与单克隆抗体相比，易出现交叉反应，而且是即便是用相同抗原制备的不同批次的多抗也不能保证其一致性，因而多抗在特异性、一致性方面有很大局限。

但多抗有制备时间短、首次制备成本低的优点。

5、免疫酶组织技术常用于标记物的酶有哪些，试比较其优缺点。

答：①常用的标记酶：1)辣根过氧化物酶（HRP）易获得,分子小,易穿透到细胞内；2)碱性磷酸酶(ALP)；3)葡萄糖氧化酶②比较（百度去吧）6、免疫组织化学中实验结果的判断如何进行答：免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。

①阳性反应的染色特征：1)阳性细胞分布呈灶性和弥漫性；2)阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。

②假阳性及其处理：1)所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别是使用多克隆抗血清时较易出现；2)组织细胞内含有DAB沉淀相类似的色素;3)假过氧化物酶活性：组织中存在红细胞时，即不加过氧化物酶，也可出现阳性结果。

③非特异性染色特征:1）组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称非特异性背景染色；2）常出现在切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，表现为无一定的分布规律，常呈现某一部位成片的均匀着色。

7、简述体视学中抽样设计时应该注意的事项。

（书P.110）答：①确定总体或参照空间，样本要取自整个参照空间；②样本含量不是由参照空间的大小确定的，是由特征物在参照空间内的分布情况、抽样方法和拟获得的一定的准确性确定的；③样本的抽取应该是随机的，应排除主观影响；④抽取切片、视野等研究一定条件下的某种生物器官时，实际用于计算平均估计值、标准差等的样本是生物器官构成的样本，样本含量就是生物的数目。

切片仅是估计某一生物器官的样本，视野仅是某一切片的样本；⑤阶段抽样的重点是较初级阶段的抽样，阶段抽样的原则是：宁多而粗，勿少而精；⑥若最终计数的测点数已达100—200个，则样本含量已足够；⑦注意选择适当的显微放大倍数；⑧做一试点研究或实际考察对于抽样设计是很有用的，尤其对于一项新开始的研究。

8、简述细胞凋亡研究在免疫学中的重要意义，细胞凋亡的检测方法和原理。

答：①在免疫学中的意义：细胞凋亡对于淋巴细胞的成熟和维持免疫系统的功能至关重要。

在淋巴细胞的发育分化过程中，自身反应性B细胞克隆的清除以及通过一系列阳性选择和阴性选择，形成CD4+辅助性T淋巴细胞和CD8+抑制性T 淋巴细胞的过程，都是通过细胞凋亡来实现的；LAK等免疫活性细胞可以通过诱导细胞凋亡来杀伤靶细胞；为了防止过高的免疫应答，受抗原刺激而活化的T 淋巴细胞自身可以通过诱导细胞死亡过程走向凋亡。

②检测方法：1）形态学方法，包括光学显微镜观察、视频时差显微技术、电子显微镜观察等。

原理：凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体；在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，与周围细胞分离，不引起炎症反应。

2）生物化学方法，测定染色体DNA断裂及其细胞形态。

原理：细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，染色质DNA在核小体间被切割成50—300kb的片段，或180—200bp整数倍的单或寡核苷酸片段。

细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的连续的梯形DNA图谱。

3）免疫化学方法。

原理：细胞凋亡时，细胞染色体DNA断裂，断裂的DNA与组蛋白H2A、H2B、H3和H4，形成复合物，保护其DNA不被核酸内切酶降解。

采用抗组蛋白和抗DNA 的单克隆抗体酶联免疫分析法进行测定，即可显示细胞凋亡。

4）分子生物学方法。

原理：细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的断裂。

此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸3，-OH端予以显示。

9、实验设计：碱性蛋白酶在细胞中的分布，定位的原理、方法及结果显示。

另四道题1、组织化学技术的基本要求。

答：①尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。

为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。

②化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。

为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。

③反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。

颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。

④反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。

⑤反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。

⑥反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。

2、免疫组织化学技术包括哪些？（或参照书P.15）答：①根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类：1）直接法将标记物与第一抗体结合后，直接加到细胞或组织上，在适当条件下，抗体与抗原反应。

2）间接法与（待检物）抗原特异性结合的第一抗体未被标记，而第二抗体以荧光素、酶或胶体金等标记。

②根据标记物或呈色物的不同分类：1)免疫荧光法2)免疫酶组织化学法3、荧光标记/抗体标记中，其主要作用是消除或降低非特异性荧光和交叉荧光染色的影响，其方法和步骤是什么？（书P.61)答：①用于标记的抗体应该特异性强并且效价高，标记后通过层析或透析的方法去除游离的荧光素。