DNA提取中各种实验试剂作用原理

D N A提取中各种实验试剂

作用原理

Prepared on 24 November 2020

DNA提取中各种实验试剂作用原理

1、STE 是Tris-Hcl 、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。

提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。

EDTA：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。

NaCl，有利于DNA的溶解。

2、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，

3、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase 的活性。

Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。

4、氯仿的作用

克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

6、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝）和硼酸系统（pKa=）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。

8、STE 是Tris-Hcl 、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。

提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。

EDTA：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。

NaCl，有利于DNA的溶解。

9、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，

10、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。

Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用

克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

12、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

Tris

中文品名: 三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 缓血酸胺

Tris结构式

英文品名: Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane

英文别名: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

THAM; Tris base; Trometamol

通用CAS : 77-86-1

产品纯度: 100%(USP药典级) / %(实验室技术级)

产品级别: USP药典级,符合USP/EP/cGMP对药物赋形剂的要求

分子式: NH2C(CH2OH)3

分子量:

使用用途: 生物制药,体外诊断,个人护理及化妆品原料等

保存温度: 常温密封避光保存

TRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成PH值为，，，。其PH值随温度变化很大。一般来说，温度每升高一度，PH值下降。

1M TRIS-HCl 和1.5M TRIS-HCl 是SDS-PAGE最常用的试剂。

而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE（）主要用于溶解DNA。TE为 Tris加EDTA合称。

缓冲特性：Tris为弱碱，在室温（25℃）下，它的为；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在到之间。Tris碱的水溶液pH在左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris 的pKa的影响。

衍生缓冲液：

由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓