高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM

高效快速筛选新发现的微卫星位点的方法-HRM
摘要：本文介绍了一种新的识别微卫星位点的方法，微卫星标记是一种功能强大的共显性标记，扩增产物可靠且可以确定已知物种的高度的多态信息含量，但是对于新位点的发现依然是一种费时费力的方法。

相对于大肠杆菌文库分离方法，新一代测序技术（NGS）可以得到更多可用的候选基因。

我们对已知微卫星引物的注释作了系统的论述，并发现无论采用什么分离技术，由于PCR 未充分扩增，基因位点的单态性或多拷贝都会导致一半以上的候选基因丢失。

因此，在分子标记技术上，筛选候选基因依然是一个很关键的步骤。

我们通过重新评估毛细电泳法进行基因分型，发现HRM可以用于基因分型及筛选候选基因，对此列出了具体的流程。

通过该流程，或许我们可以快速地进行新一代标记的检测，并可以把费用降低到传统方法的一半甚至四分之一。

关键词：HRM 微卫星重新分离技术分子标记新一代测序技术群体遗传学
引言
微卫星也叫简单重复序列（SSRs），是群体遗传学中最强大的共显性标记，具有广泛的应用(e.g., Chambers and MacAvoy 2000; Ellegren 2004; Jarne and Lagoda 1996;MacDonald et al. 2011)。

最近由于新一代测序技术（NGS）的发展正解决SSRs技术中的一个重要的缺陷，不能获得足够的设计引物的数据。

扩增片段多态位点的选择，依然是一件费时费力的工作，这是SSRs发展
中的另一个瓶颈。

因此我们引进了HRM用于识别潜在的SSR位点，并且HRM有望加快SSR的发展速度，降低传统方法的费用。

SSRs 一般是以核心序列1-6bp为重复单位首尾串联而成的短的DNA序列(Wan et al. 2004)。

微卫星具有高突变率、易于进行PCR扩增、便于毛细电泳法(CE)的分析以及可以利用许多软件工具进行生物学推论的诸多优点，使其在群体遗传学方面得到广泛应用。

传统的SSR位点的重新分离，是借助于丰富的基因文库(Glenn and Schable 2005; Zane et al. 2002)，但是该法对于SSR位点不多的物种则不能检测到足够的位点进行分析(Arthofer et al. 2007; Megle´cz et al. 2004)。

由于NGS的不断改进，尤其是罗氏454 FLX 钛化学（ Titanium XL ?试剂盒可以使其被更广泛的应用）能够识别更多的片段，NGS如今已逐渐取代克隆文库(Castoe et al. 2010; Santana et al. 2009; Vanpe´ et al. 2009)。

最重要的一点是NGS建立了无可比拟的信息含量，而在大部分文献中大肠杆菌文库的克隆序列却低于1000个（参考本文文献评论），NGS可以产生成千上万的序列，其中SSR位点达好几千。

这些重复区域可以用来设计引物，也可以用软件包进行分析了(Kofler et al. 2007; Megle´cz et al.2009)。

借助于传统的和是基于NGS的分离技术，就可以对扩增的新位点、基因组中单拷贝位点及丰富的多态性进行检测。

筛选步骤通常包括个体序列的扩增，确定扩增片段质量的凝胶电泳和评定等位基因多样性的毛细管电泳。

高分辨率熔解曲线分析技术（H(Graham 2005; Wittwer et al. 2003; Zhou et al. 2004,2005)RM）是一种用于PCR产物分析的均一性好，真正的闭管操作技术。

首先是添加荧光饱和染料进行PCR扩增，然后是高精度的熔解，在这个过程中随着荧光的减少，可以监测到DNA双链向单链的转变。

这种变化是随着DNA片段长度和序列变化而产生的，并由荧光衍生物形成的曲线的峰值反映，峰值是HRM仪器通过感应解链过程引起的温度(dF/dT) 的的变化而出现的(Tindall et al.2009; Wu et al. 2009)。

仅仅含有一种类型的DNA序列的PCR反应（如二倍体的纯合子模板）只产生一个峰的dF/dT曲线。

杂合子模板（如有两个不同等位基因的模板）会产生不同的纯合子(A1A1, A2A2) 和杂合子 (A1A2)。

由于纯合子链的不完全结合，熔解温度比杂合子低的多，结果在dF/dT曲线的峰值出现的较早(Mader et al.2008)。

两种均聚物的不同的序列通常不能形成两个可以明显区分的峰，如杂合子模板除形成一个与杂聚体相关的曲线外，一般还形成一个与均聚物相关的一个峰值的dF/dT曲线 (Mader et al. 2008)。

多拷贝位点或者无特异性的共扩增产物将会引起更复杂的杂聚体形状和其它的dF/ dT峰值。

与之相反，任何峰值的缺失表明扩增过程中没有进行充分的扩增。

HRM除了应用于临床上进行突变扫描，还可以用于数量遗传学的基因分型(Smith et al. 2010) 及识别亲缘关系相近的植物突变体的不同(Mackay et al. 2008; Mader et al. 2010)。

Mader
等人(2008)阐述了HRM在SSR分析中应用的理论依据以及与毛细管电泳相比的缺陷。

也就是说，HRM只能完全分析有几个等位基因的低复杂性的SSRs，对未知PCR产物需要与标准基因型比对，这使分析程序变得复杂费力。

因此，在群体遗传学中，我们或许不能用HRM代替CE对高度复杂的SSRs位点进行基因分型。

但是，在对SSR设计适当的引物进行识别及初步测序后，HRM 可以简化筛选程序。

如下：（1）我们通过对比传统和基于NGS对SSR进行分离而引起的候选基因的丢失，对已发表的SSR引物注释进行了系统的分析，我们发现在标记测试中，对于用于筛选的引物，对其选择的严格程度对位点的质量几乎没有影响，即尽管对NGS数据进行了十分严格的选择，但对引物的筛选依然很重要。

（2）我们用HRM重新分析了已分型的14种SSR标记物，并与CE的分析结果进行了比较，表明HRM在筛选过程中的好处。

（3）用192个个体的扩增试验的20个等位基因来验证HRM在基因型研究框架上的概念，（4）最后，我们拟定了HRM在进行快捷有效地筛选高质量的SSR位点的使用流程。

材料和方法
一个包含SSR位点的序列转变成功能性的基因标记物通常有几个步骤组成，这些步骤可能并且通常会导致候选基因的丢失。

尽管这些丢失无论从时间还是金钱上来说都是很昂贵的，但一直没有详细的报道。

我们通过对2008年发表在分子生态资源上的所有引物的进行系统的分析，评估了常规的SSR标记的成功率，单
独发表了最后一卷的引物分析。

综述包括了可以提供所有最初检测的引物对的数量及多态位点的总量的所有文章（论文数量=238；见表 S1, S2）。

提供足够数据进行推断的文章的一部分：•已知序列文库克隆的数量 (n = 181)
•含有SSR位点文库克隆的比率(n = 133)
•选为引物测验克隆的SSR的比例 (n = 133)
•由于PCR未完全扩增造成的基因的丢失(n = 72).
为了比较常规的SSR与基于新一代测序技术上的SSR的结果，我们利用发表在2011年7月10号之前借助于NGS的文章做了一个相似的评论，这些文章提供了引物对的数量及多个位点（见表S1, S3）。

常规PCR和毛细管电泳
我们在实验室中用以前发表的蚂蚁（膜翅目）的SSR设置了两组对照试验，以比较传统的SSR基因分型效果与HRM的分析效果，这些蚂蚁属工匠收获蚁(Arthoferet al. 2005)和长白山红蚂蚁(Steiner et al. 2007)，其分类为石蛃属(Microcoryphia)，所用基因是两个新发现的还未发表的SSR位点。

用于最初的基因分型的蚂蚁的DNA于-20℃保存备用，有足够的用于HRM反应所需的提取物。

用下列引物对M. Pallida位点进行常规的扩增：
Mp1-61F(CACGACGTTGTAAAACGAC-TAGCAGAGGGTGGAGTGCTTGG)
Mp1-61R (TTCACGCTAAAAAGCACCGCC)
Mp1-64F (CACGACGTTGTAAAACGAC-CACTCTGTACACGGAAAATTCG)
Mp1-64R (GCTGGTGTCCTTTGACCTTC)
以10:1比例标记M13引物，然后用该引物追踪19 Dream Taq chemistry (Fermentas)的上游引物。

PCR反应：94℃预变性5 min；94℃变性30s，60℃退火45s 以及72℃延伸60s 共35个循环；最后68℃延伸20 min。

PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳检测，通过与0.25 lg试剂盒的500bp的带型相比较，然后对扩增产物的浓度进行分类，100bp+梯度（-，无条带；+，条带比梯度的弱；++，条带与梯度相同或强与梯度）。

商业供应商完成毛细管电泳分析，通过PeakScanner软件(Applied Biosystems)可以把电子影像分析图可视化并且可以对其评分。

高分辨率熔解曲线分析
随机挑选12个经毛细管电泳分型的工匠收获蚁和长白山红蚂蚁个体，每种各6个个体，进行HRM分析。

我们选择了代表下列扩增模式的14个SSR位点：PCR扩增失败、单态性位点、PCR产物在凝胶电泳图像上出现条带丢失或多条带的位点及多拷贝位点（见表1）。

用1× Type-it HRM Mastermix (Qiagen)的Rotorgene Q (Qiagen)PCR系统进行扩增和HEM分析，10ul反应体系中0.2 um 特异性SSR引物和0.8 ulDNA模板（ca.10ng/ul）。

循环条件：95℃预变性3 min；95℃变性10s，55℃退火15s 以及72℃延伸20s 共70个循环；最后68℃延伸20 min。

每个延伸阶段末都需要进行荧光标记。

为确保扩增片段的均匀复性需要保持95℃ 1 min，40℃1 min的2个循环。

高分辨率熔解曲线分析程序：65℃保持1 min，
以0.1℃的速率从65℃连续升温至90℃，每步保持2 s后进行荧光收集。

用Rotorgene software(version 1.7)进行比较定量及熔解曲线的分析。

用以下三个参数衡量每一个标记分析结果：（1）每个个体的溶解曲线派生图峰的数目，dF/dT阈值可以通过人工进行调节，以遮掩杂波(Fig. 1)。

（2）每个提供参数的峰的解链温度(1)；用于计算相同位点的特异性引物解链温度范围的所有温度值。

（3）所有个体的比较定量分析；我们选择有大量PCR扩增物的个体作为校准复制，该值定为1，并计算了所有用相同位点的特异性引物进行扩增的个体的平均值和标准差。

在基因分型研究中检验HRM的概念
为了检测我们提出的HRM在较大研究中筛选基因位点的应用，我们尝试分析20个跨物种的位点，这些位点来自于亲缘关系较近的Tetramorium sp. E 、 T. tsushimae (Steiner et al. 2007)和T. alpestre (Steiner et al. 2010)。

按上面的步骤，用HRM对随机选取的8个蚁穴进行了分析。

在ABI 3130序列分析仪方面，熔解曲线有1-2个峰及温度范围≧0.35K的扩增产物会受到片段分析的影响。

最后，我们挑选了8个较好的位点，并用毛细管电泳对16个蚁穴中所有个体（每个蚁穴12个个体）进行了扩增和基因分型，并把获得等位基因的数目与HRM预测的多样性进行了比较。

在基因分型的研究中，我们用毛细管电泳分析中观察到的三个位点来估计不完整的片段对解链温度范围的影响，这三个位点
分别是最低表达、中间表达、最高表达的不完整的片段。

为此，我们用与筛选分析相同的DNA来进行重复，扩增过程的变性温度被降到83℃,这就避免了断断续续的片段的形成(Olejniczak and Krzyzosiak 2006)。

这样就可以比较最初筛选和最低变性反应的温度范围。

结果
对已发表的SSR位点进行系统的综述
2008年是《分子生态资源》作为单独发表引物说明的期刊的最后一年，也是新发展的SSR标记没有使用新一代测序技术的最后一年。

在这一年，该期刊共收录了362个引物的注解，其中的238个经过最初的测序后检测了引物对的数目，这些在该评论中都有说明。

238篇文章共描述了已检测的8，826个微卫星位点，其中的3，465（39.3%）还进行了扩增和多态性分析。

平均每个研究分析了196.3个序列，检测了37.1对引物，扩增效果良好的位点24.2个，作为多态标记并最终被发表的位点是14.6（见表S1）。

2011年7月10日科学网用[454或ngs和microsat*]作关键词搜到利用NGS检测SSR位点并符合我们标准的研究有22篇（见表S1，图2）。

与常规文库形成鲜明对比，平均每个研究分析了167，747个序列，即，几乎是常规文库的1000倍。

包括微卫星位点的序列的比例也比常规方法高得多（50.7：2.4%），可能因为我们常常用大肠杆菌文库检测微卫星的丰富度，而不是用新一代测序技术。

由于有更多的可用序列，新一代测序技术（1.33%）在后
续的引物发展过程中就不需要太多的位点了，常规方法（85.0%）却不尽然。

无论哪种方法，60%以上的片段都被很好的扩增，其中可以作为多态标记的低于40%。

其它的则因为扩增不完全、单态性、多拷贝或计数困难而不能继续进行分析。

高分辨率熔解曲线分析
对0-12个样品的每一个位点的分析发现，实时荧光定量PCR 与常规PCR的分析结果除以下五个位点的分析不同外，其他不能检测到的样本的数量完全一样，这五个为点位：1f、2c、3e及52b，三分之一的提取物不能进行实时荧光定量PCR扩增，却可以进行常规PCR扩增；位点inlocus12e，两份提取物不能用常规PCR进行分析，在实时荧光定量PCR扩增中却可以检测到峰值（见表2）。

有两个以上峰的曲线表明是多拷贝位点或非特异性扩增或扩增产物含有多个突变位点 (Wu et al. 2008)。

位点1f、3e、12e及59h都属于这些类型。

毛细管电泳检测到位点3e和59h属于多拷贝位点，无效等位基因和条带模糊干扰了毛细管电泳对位点12e的计数分析。

有些位点可以进行CE评分却平均含有5.25条非特异性模糊条带，我们通常把这种现象作为解释出现多个dF/dT 峰值的原因。

我们观察到单态性位点Mp1-61的解链温度区间是0.12K,严重受到模糊条带影响的 1f位点的解链温度区间是12.45K。

当消除这些潜在的多拷贝及受模糊条带影响的位点后，片段大小和温度变化区间的相关性就很容易发现了（见图3）：单态性位点 Mp1-61和Mp1-64的温度变化范围小于0.5K，而多态位
点2a则在0.7-3.92K。

我们不能确定温度区间与位点多样性的确切的关系。

通过选择每个被充分扩增的样品的位点作为定量分析的校准物，我们把其它样品与校准物的比值记为该样品的值。

位点12e 在常规PCR扩增过程中出现了许多错误的扩增物，其平均相对值最低，为0.18，位点13j的最高（0.61），表明该位点的扩增产物的质量超过其他的样品。

在基因分型研究中检验HRM的概念
在HRM筛选的20个位点中，排除了其中的未充分扩增的8个位点（51c、52d、52k、53a、53b、54g、56d、59j），这些位点在熔解曲线图上出现了1-3个个体没有峰值的情况（见表3）。

在所有的这些位点的熔解曲线上，只有一个个体（53b）出现了多个峰值，这说明这个位点是多拷贝位点。

剩余位点的解链温度区间是0.1-2.55K。

这些位点中的9个位点（51b、51d、51i、51o、52a、55a、56h、57l、58i）具有很高的解链温度（≥0.35K），除58i 外的其他8个位点被选为进一步分析的位点，排除位点58i仅仅是技术的原因（片段大小及标记都不适合进行CEmultiplexing分析）。

192个个体的基因分型的结果如表3和图4所示：经过筛选的所有位点除个别缺失外都有很好的扩增产物；解链温度与在筛选及分型步骤中的片段的长度都有很密切的联系（R2分别为0.59，0.76）；在基因分型中每一个位点的等位基因数是8-21；解链温度和等位基因的数目之间的关联性很低但依然呈正相关（R2为
0.04）。

把扩增后的三个不同程度断裂的等位基因的解链温度降低到83℃，其温度区间和正常扩增片段的几乎没有差异，这表明断裂片段对所观察的解链温度的影响很小（见表3）。

讨论
对于群体遗传学来讲，微卫星标记是可用的最强大的共显性标记。

微卫星的高进化率使其不但可以追踪近代发生的进化事件，而且限制了已有标记在跨物种上的应用(Barbara´ et al. 2007)。

新发展的SSR标记极大地改变了跨物种甚至亲缘关系很近的物种的分析方法(Arthofer et al. 2007)，我们发现有些生物体事实上只含有少数的微卫星位点，如，菌类(Dutech et al. 2007)，鸟类(Primmer et al. 1997)，螨虫类(Navajas et al. 1998)及其它节肢动物(Fagerberget al. 2001)。

不断改进的新一代测序技术在SSR研究中的应用，正逐渐取代基于大肠杆菌文库的方法，同样的花费，新的技术可以完成成千上万个序列的检测，却只有几百个大肠杆菌文库可以用来测序。

技术的改变不仅提高了微卫星标记的收益率，而且使研究者面临前所未有的微卫星序列。

进来研发的软件包(e.g., Megle´cz et al. 2009)可以帮助筛选出很多好的位点，这些位点有适当引物结合点，并且可以长时间进行很好的重复。

通过把传统和基于新一代测序技术在微卫星标记的结果进行对比分析，我们发现以下两个主要区别（见图2）：首先，新一
代测序技术测定的序列只有2.4%的含有微卫星图，而常规的达到50.7%。

这可能因为对测定序列的预期太高，22项研究中只有4项在新一代测序技术测序前有丰富的微卫星位点，而大部分传统文库的多态含量很丰富，就产生了更高的微卫星位点密度。

其次，新一代测序技术中检测的微卫星位点，只选择了1.3%进行后续的引物测验，而传统方法则为85.0%。

不幸的是，我们还没找到具体的选择标准，但我们推测当有足够可利用的测定序列时，会清理掉一些序列，这些序列含有短的微卫星位点及复合图形或不易分辨的侧翼区域。

而且，大多数研究者可能会针对出现最多的位点来确定他们研究的框架；一组16-20个的标记就可以为大部分群体遗传问题提供足够的准确度(Beacham et al. 2006; Hess et al. 2011)。

显而易见的是，新一代测序技术可以对位点进行严格的选择，但这对引物的表现几乎没有影响：对于常规(60.7%)和基于新一代测序技术(62.0%)扩增的产物，经测试后，一半以上由于未完全扩增或多态性不足而被淘汰。

因此，我们得出结论，当存在大量位点时，在进行测序后的筛选步骤也很重要，比如通过新一代测序技术可以完成，这样提高了选择的严密性。

筛选的一般流程是：设计引物，合成具有标记的寡核苷酸，少量个体的PCR及用毛细管电泳进行基因分型。

用这种方法合成引物的每个位点的真实费用大约是€ 61（标记35 €，对于20-mer F 引物，每个碱基0.85 €，一个未标记的R引物，每个碱基0.43 €；所有花费计算参考http://www.microsynth.ch列出的价格，2011
年1月26日下载），当检测12个个体时，PCR和CE过程需要花费，假设一个CE循环需要加三种染料。

过去几年，在SSR的研究中，我们很喜欢用M13-tailed primers (cf. Schuelke 2000)，这样会使引物合成的成本降到26 €。

我们再来估计一下12个个体和3个位点所需要的时间，从提取DNA开始，假定有一个8孔的毛细管电泳装置，大概需要8 h，其中3.5 h需要手动完成。

HRM的引物合成需要17.2 €，（如果包括M13 tails是26 €），当检测12个样品时，用Type-it HRM Kit (Qiagen)进行10 ul反应体系，完成实时荧光定量PCR和HRM的费用是4.5 €。

高分辨率熔解曲线分析法使基于毛细管电泳法的费用降低到49%（用M13)—78%（用直接标记的引物）。

的72孔的转子可以在一个3 h的循环中同时检测6个候选基因，后PCR阶段不需要任何液体的处理。

建立PCR及处理数据大概需要2.5 h；因此，就处理时间而言，HRM 也优于常规PCR和CE。

我们展示了应用Rotorgene Q仪器进行扩增和熔解分析过程中出现的数据，以便对已知位点在以下几个方面做出推断(1)扩增效率，（2）不同样品扩增的一致性，（3）复制及非特异性模糊条带的出现或缺失可能会影响后续的多重应用Guichoux et al. 2011)，（4）扩增片段的大小。

尽管我们不能总是保证高度的等位基因数目，样品间片段长度差异过大会影响到多态性，这是由微卫星位点不断变化的特点决定的(Dieringer and Schlo¨tterer 2003; Valdes et al. 1993)。

最后，我们已经证明了高
分辨率熔解曲线分析在20个来自跨物种扩增的微卫星位点上的应用：由HRM筛选的8个个体的8个位点，这些位点在对192个样本的分析中，显示较低的丢失率和较多的等位基因数目。

基于这些推论，我们提出了一个简单的流程用来筛选高质量的位点，包括以下六个步骤：
1.确定未标记引物的加入顺序。

防止用于后续的基因分型，尾部可以很容易的添加到F引物上。

这增加了额外的费用，但如果位点可以用于后续的分析，避免了重新合成引物的花费。

2.一系列用于实时荧光定量PCR和HRM的样品。

3.遗弃无峰值的样品的位点（表明PCR反应失败）和则含有两个以上峰值的位点（表明多拷贝情形、多突变位点或非特异性模糊条带的扩增）。

在某种程度上，出现两个以上峰值的复杂位点可能会给出一些有用的标记。

毕竟，考虑到在新一代测序技术中检索到的大量的候选基因位点，遗弃这种位点应该是十分可行的，有助于实现更快更直观的流程。

4.估计剩余位点的解链温度范围。

在样品中，较大的温度变化范围与片段大小的差异是有联系的，当所有样品的位点在一个很小的温度范围内，这些位点可能有更少的多态性。

具有很大温度变化范围的位点更适合被选作用来进一步的基因分型。

前提是我们必须首先排除所有的多拷贝位点，因为多拷贝位点可能会有很大的温度变化区间。

5.可选择性：为了确定标准扩增物与多个样品的比值，我们要规
定扩增物浓度的相对量。

6.可选择性：调节退火和变性的温度，重新进行qPCR和HRM分析，这样是为了消除非特异性扩增和不连续性。

对于HRM方法，理论上可能会出现的两个错误：（1）错误通过，即，被认为很有继续分潜力的位点事实上却是单态性或多拷贝位点，（2）错误排除，也就是说，被遗弃的位点是可以形成多态性的位点。

对于（2）这种情形，虽然在引物合成和HRM试剂方面产生量一些损失，但考虑到来自NGS的大量的可用候选基因位点，这不足为忧。

而（1），当位点经毛细管电泳后，不具有多态性，这就会造成很大的经济损失。

因此，尽管在我们的研究中没有出现这种现象，但这种情况依然值得进行讨论。

HRM已经被证明是混合模板中检测标记序列变异的一种十分有效的手段(Dobrowolski et al. 2009;Graham 2005; Seeb et al. 2011; Tindall et al. 2009)，这种方法可能会丢失一个等位基因的多拷贝的出现，该法可以排除这个丢失的位点。

此外，与毛细管电泳法不同的是，HRM不仅可以用来扩增片段长度，而且可以推断出所有扩增序列的变异。

因此，一个重复区域呈单态性的微卫星位点，却在它的侧翼序列发生了突变，这个位点将被认作是多态性的—这个特点在后续的毛细管电泳分析中不会再进行复制。

侧翼序列的突变在微卫星分析中是很有说服力的事件，我们在理论上可以理解它们对群体遗传的研究的影响(Angers and Bernatchez 1997; Colson and Goldstein 1999;Grimaldi and
Crouau-Roy 1997)。

事实上，对于复杂突变的模型，我们很难筛选到微卫星位点的数据。

我们只评价HRM在微卫星位点在重复区域的增加或丢失的应用，其变异性的应用不是本文研究的范围，但是我们注意到在HRM分析中呈现多态性的位点，在后来的CE检测中却只有很少甚至没有多态性，这极可能是受到侧翼序列多样性的影响。

近来，Guichoux等人(2011)批评了在微卫星研究中几乎没有人采用多重PCR的方法，但也强调了单一PCR可以验证位点的有效性，这也是进行多重PCR设计的一个首要必备条件。

这里介绍的工作流程，单独强调了每一个位点，在多重微卫星位点筛选程序发展的过程中，这些可以看作是一种很重要的工具。

目前测序技术的大转变不断影响着微卫星标记的发展；同时，HRM被认为是一种应用于群体遗传学的极有潜力的新兴技术(Smith et al. 2010)。

我们已经证明了HRM是一种快速有效的筛选高质量的微卫星位点的工具，并可以优化引物设计的工作流程。

它可以进一步帮助识别复杂进化生物的微卫星位点。

鉴于由NGS提供的前所未有的大量的序列数据，无论对于生物信息学还是生物安全实验室，都需要快速直观的分子标记方法。

尽管与NGS 相关的软件的数量不断快速的出现，但近十年来，对于候选基因的引物的检测技术依然没有太大的进展。

这里介绍的流程将促使微卫星检测的步伐与高速发展的分离微卫星的步伐相一致。

致谢（略）
参考文献（略）。