免疫分析法ppt

兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高
效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相 色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射 电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电 泳－离子阱质谱等方法。
Hale Waihona Puke Baidu
二、免疫分析法
免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。
特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。
用已知不同浓度 的标准物Ag和一 定量的*Ag及限 量的Ab反应，随 着Ag增加， *Ag 与Ab结合的少，
二者变化如右图
所示。游离的 *Ag为F, *Ag-Ab为 B。
RIA反应示意图
放射免疫分析法——原理
B／(B+F)与Ag的量存在 着函数关系，绘制得标 准曲线。将未知浓度 样品按同样条件操作， 所得结合率(％)与标准 曲线相比，即可得出样 品中待测抗原的浓度。
甲基苯丙胺(MA)及其代谢物自尿排出体外 ，可以通过检测尿液中的苯丙胺类兴奋剂及 其代谢物来认定吸毒者。通过建立甲基苯丙 胺放射免疫分析法 ，采用碳化二亚胺法制备 甲基苯丙胺半抗原，免疫兔使其产生相应的 抗体与Na125I标记抗原组成试剂盒，检测人体 体液中的甲基苯丙胺(MA)。
放射免疫分析法——应用
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
二、免疫分析法
分类： （1）酶联免疫分析( enzyme－ linkedimmunosorbent assay，ELISA) （2）化学发光免疫分析( chemiluminescence immunoassay，CIA) （3）放射免疫分析( radioimmunoassay， RIA)
1、酶联免疫分析法(ELISA)
1、酶联免疫分析法(ELISA)
酶联免疫分析法——原理
通过在合适的载体上酶标一定量的抗原与未知抗 原竞争固相抗体结合位点，形成抗体复合物。在 一定底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水 解氧化或还原成另一种带色物质，由于酶的降解 产物与显色成正比，因此可通过酶标仪来测定， 从而确定是否存在未知抗原及其含量。
酶联免疫分析法——应用2
2、放射免疫分析法(RIA)
• 简介
1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核 素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA)。
• 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫
化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种 超微量物质的测定方法。
酶联免疫分析法——原理
酶联免疫分析法——特点
优点：快速 特异性强 分析容量大 安全可靠
应用：适用在现场筛选和大量样本的快速检测
酶联免疫分析法——应用1
• Daniel 等用酶联免疫分析法多项检测，定性、定 量检测了蛋白同化激素。这个方案结合不同的交 叉反应性与分布多元数据分析技术的多元竞争 ELISA实验。用新型k-最近邻分类法分析了主成分 。这个方案可以同时检测四种浓度范围为0.1 316.2nmol/L不同的类固醇，甚至在交叉反应的前 提下总的检测正确率也可达90.6%。
注：T=B+F
标准曲线
放射免疫分析法——特点
• 优点： 1.灵敏度高，其最小检测值可达ng至pg水平; 2.特异性强:由于抗原抗体反应的高度特异性，
该方法具有很强的特异性不需要对样品进行提纯 即可直接测定;
3.重复性好、准确性佳、快速简便，免除了烦 琐的化学提纯步骤；
4. 药盒种类多、标本和试剂用量少，测定方法 易于规范化和自动化等。
2、放射免疫分析法(RIA)
放射免疫分析法——原理
• 建立在标记抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)对限量的特异性抗体 （Ab）的竞争性结合反应。
• *Ag与 Ag 具有等同的与Ab结合能力。 • 竞争结合反应可用下式表示：
*Ag + Ab↔*Ag-Ab + Ag ↕
Ag-Ab
放射免疫分析法——原理
1、采样
1天分8个时 间段，上、 下午各采四 次，每组间 隔45min； 收集的尿液 在-20℃保存
待检验
2、样品前处理
取尿液于小 离心管中，
离心，取 上清液供 RIA分析
3、检测
取50μL样品、 100μL 1:600抗 血清和100μL 125I-MA;37℃孵 育45min，加 分离剂500μL， 放置15min， 以3000r·min1离心15min，
放射免疫分析法——特点
• 缺点： 1.检测中有放射性污染，对操作人员有一定的
辐射损害； 2.放射性废物处理上的困难和对环境有一定的
污染；
放射免疫分析法——应用
（尿液中苯丙胺类兴奋剂的检测）
甲基苯丙胺(MA)属于苯丙胺类兴奋剂，作 用于中枢神经系统，具有药物依赖性及毒理 学特性，是我国最为严重的滥用毒品之一。
酶联免疫分析法——应用1
酶联免疫分析法——应用2
• Eva M 等将牛血清白蛋白多克隆抗体与孕三烯酮3 - 羧甲基羟胺耦合，创建了两种高灵敏度、特异 的检测孕三烯酮的酶联免疫分析法。实验A，半抗 原蛋白涂层条件下的检测限为0.09±0.03ng.L-1 。实验B，在共轭蛋白涂层的条件下，检测限可达 到0.14±0.05 ng.L-1。两个免疫测试都具有高特 异性，与其他合成代谢类固醇没有任何交叉反应 。一般条件下的可运用于未预处理的尿液样本中 类固醇的检测，回收率可达到76~122%。
抽干。
4、结果
γ一记数 仪记数， 并自动计 算尿中MA
浓度 (ng·ml-1)
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检 测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术 (RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的 特异性，更兼有发光反应的高敏感。
免疫分析法ppt
兴奋剂的检测方法
之免疫分析法
一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法
（1）酶联免疫分析法 （2）放射免疫分析法 （3）化学发光分析法
一、兴奋剂的概念
1964年，国际运动医学会的国际兴奋剂 会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的 运动员使用任何异体物质，或以不正常的 量和不正常的进入机体的途径使用生理物 质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛 成绩的行为。