实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

以蛋白质为例：
COOH＋
COOH＋
COOH
Pr
OH－
Pr
OH－
Pr
NH3
+
NH2
NH3+
pH>pI
pH=pI
pH<pI
影响电泳迁移率的因素：
1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、
蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象
常见的电泳有：
1、醋酸纤维膜电泳、 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 3、毛细管电泳
3.点样：
点样前，取一张干净的滤纸，在距一边1.5cm处用铅 笔划一条平行线作为点样标志区。 点样时，用毛细管吸取血清，在盖玻片一端均匀涂抹， 使样品连续、均匀、适量，把盖玻片在薄膜毛面上轻而温 和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。 此步是实验的关键。
1.5cm 6.5cm
点样区
思考题
1.用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么 优点？ 2.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？ 3.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操 作？
小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 清蛋白 α 1球蛋白 α 2球蛋白 β 球蛋白 γ 球蛋白
骨髓瘤
肾病综合症 肾炎 肝硬化 急性肝坏死 传染性肝炎 急性感染初期 慢性炎症/感染后期 低球蛋白血症
染色剂
• 一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽 春红
• 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂 • 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色
实验器材
1、电泳仪及电泳槽 2、醋酸纤维薄膜（2×8cm） 3、培养皿 4、点样器（盖玻片） 5、滤纸 6、玻璃板（可用大培养皿背面代替） 7、镊子 8、毛细管 9、刀片
β－球蛋白
γ－球蛋白

5.12
6.85～7.3
90,000～150,000
156,000～950,000

6.5～12
12～20
缓冲液pH=8.6
pI＜pH
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动
醋酸纤维薄膜电泳
• 醋酸纤维薄膜作为支持介质
• 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯， 溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度 为0.1～0.15mm
盐析法 有机溶剂沉淀法 离子交换层析 吸附层析 电泳法 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析
分离方法
层析法 电学法
等电聚焦
超速离心法
实验原理
电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相
反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不 同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的 电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它 们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。
醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）
4.电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 （点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜 紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节 电流强度0.3mA/cm膜宽度（8片薄膜则为4.8mA）。通电
10-15min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度（8片薄膜则
为8mA），电泳时间50-80min。电泳后，调节旋钮使电流 为零，关闭电泳仪切断电源。
5.染色：
电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的 培养皿中浸泡5min，染色时可置于摇床，染色液用后回收 到原瓶。
6.漂洗：
将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直 至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上， 用吹风机冷风吹干或者自然晾干。
实验试剂
1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离 子强度0.06)
2、0.5%氨基黑10B染色液
3、漂洗液100ml
4、透明甲液和乙液各20ml
5、人血清（严格防止血清沾到皮肤上，尤其是带有 伤口的皮肤）
实验操作
1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸 纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色 一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择 质地均匀的膜)。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不 同的电极Βιβλιοθήκη Baidu红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一 根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入 缓冲液中，形成滤纸桥。
电渗作用：
电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。
以纸电泳为例:
正极 负极 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向 负极移动
－－－－－－－－ ＋＋＋＋＋＋＋＋
如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。
血清中几种主要蛋白组分：
血清蛋白质 清蛋白 α1－球蛋白 α2－球蛋白 等电点 4.64 5.00 5.06 分子量 69,000 200,000 300,000 占总蛋白的％ 57～72 2～5 4～9
实验二
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）
实验目的
1、掌握电泳法分离蛋白质的原理 2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法 3、学习蛋白质染色的方法
分离蛋白质的方法
沉淀法
透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、
大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后 的薄膜可作扫描或照相。
正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样 原点
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜 吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜 或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或 过少。 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样 面向下。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太 短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进 行复染。
↑*
↓ ↓ ↓* ↓ ↑* ↑ ↑ ↑* ↑* ↑ ↑* ↑* ↑* ↑ ↑* ↑ ↑* ↑* ↑* ↓*
7.透明
将干燥的薄膜浸入透明甲液2min后转入乙液1min，取 出后贴于干净玻璃板上，中间不能有气泡，等待至薄膜透 明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷风吹干燥， 置于自来水下冲洗，等薄膜湿润后用刀片从一角撬开并轻 轻取下，滤纸吸干水分后即可。如需长期保存可在液体石 蜡中浸润。
8.记录和分析实验结果