蛋白印迹技术(分子医学实验)
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
蛋白质免疫印迹技术
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合，有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联，为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合，可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能， 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
THANKS FOR WATCHING
改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程，提高处理效 率，降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法，提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性，进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法，减少实验 步骤和时间，提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂，降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统，简化操作流程，减 少人为误差，提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力，实现蛋白质表达水平 的准确测量，为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断，为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求，选择适当的转移 膜，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡，使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上，完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育，使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性，通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上，再与特异性抗体进行反应，通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。
蛋白质免疫印迹技术
2
特异性
该技术能够高度特异性地识别并检测目标蛋白,即使在复杂的生物样品中也不会产生交叉反应。
3
检测限
得益于优化的实验步骤和灵敏的检测方法,免疫印迹技术的检测限可达到皮克摩尔级别,能够灵敏检测极微量的目标蛋白。
4
重复性
该技术具有良好的实验重复性,可以准确定量并复制实验结果,为蛋白质研究提供可靠的数据支持。
蛋白质定量分析
可以利用Western blot结果对特定蛋白的相对含量进行定量分析,为进一步的生物学研究提供数据支持。
结果可视化展示
Western blot采用化学发光检测,可以清晰地显示蛋白条带,结合分子量标准进行数据分析和解读。
实验数据处理
数据分析
实验结果的数据处理通常包括绘制图表、统计分析和计算参数。数据分析可以揭示实验结果的趋势和特点,为后续的实验设计和结果解释提供依据。
技术改进方向
提高灵敏度
通过优化实验条件和试剂配方,不断提高免疫印迹技术的检测敏感度,以更准确地识别低丰度蛋白。
增强特异性
开发高特异性的抗体,减少非特异性结合,提升识别目标蛋白的准确性。
自动化集成
将实验流程进行自动化处理,实现样品预处理、电泳、转膜、免疫反应等步骤的高度整合,提高操作效率。
数据分析优化
2
结果解释和分析
对实验结果进行深入分析,阐述结果的意义和影响,讨论可能的影响因素。提出合理的解释和推论。
3
图表展示质量
使用恰当的图表、图像等辅助手段,直观、生动地展示实验结果。确保图表制作规范,便于理解和分析。
4
结论和建议
根据实验结果提出明确的结论,并提出后续研究或应用的建议,为后续工作提供参考。
实验设备
蛋白质印迹法
蛋白质印迹法蛋白质印迹法是一种用于检测和分析蛋白质的测定技术，它利用一种蛋白质示踪实验技术来检测和识别由有机物和分子质量谱检测的蛋白质的形状和结构。
蛋白质印迹法有助于研究蛋白质的功能、结构以及与其他分子的相互作用。
同时，它也有助于研究蛋白质在不同蛋白质组中的分子量和拷贝数，这在病理检测和基因检测中显得尤为重要。
蛋白质印迹法的工作原理：将受检的样品经由溶解、平衡和均质化处理后，将其涂布于特定的固定底物上，经过一定的温度、湿度和时间条件处理，以促进蛋白质印迹法中反应过程的完成。
随着温度、时间和湿度的改变，蛋白质示踪实验有助于检测和分析样品中的蛋白质。
在这一过程中，检测过程中分子可以在特定位置上形成印迹，基于它们在溶剂移动性、分子量和电荷的不同，就可以根据它们的印迹来分析出蛋白质的分子结构。
在蛋白质印迹法的分析过程中，也可以用蛋白质印迹来研究蛋白质的相互作用。
通过将“特定的蛋白质”与试剂混合，就可以分析出蛋白质与混合试剂之间的结合情况，从而研究蛋白质之间的相互作用。
此外，也可用蛋白质印迹法来研究蛋白质的表达和分布。
在这个过程中，实验者可以根据蛋白质的印迹图精确比较图像中的蛋白质的表达和分布，从而得出它们之间的表达量、分布和相互作用的结果。
蛋白质印迹法作为一种快速、准确、高效的检测技术，是基础生物学、分子生物学和病理学研究的重要工具，在今天被广泛用于科学研究中。
目前，蛋白质印迹法已经在许多生物学和医学领域中得到了广泛应用，如分子遗传学、发育生物学、免疫学、蛋白质组学等。
总之，蛋白质印迹法是一种非常重要的技术，它有助于深入探索蛋白质的结构和功能，并为免疫学、分子遗传学及其他应用领域提供了有用的信息。
未来的研究将注重于进一步优化蛋白质印迹法的技术条件，以及开发新型的示踪试剂、检测方法和技术，以获得更加精确的结果。
蛋白质印迹的基本原理
蛋白质印迹的基本原理
蛋白质印迹是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定蛋白质在混合样本中的存在和数量。
其基本原理是将混合蛋白质样本进行电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，再用特定的抗体与目标蛋白质结合，最后通过化学法将目标蛋白质可视化。
蛋白质印迹的步骤：
1. 样品制备：将待检测的蛋白质混合样本进行电泳分离，通常采用SDS-PAGE电泳技术。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用半湿式或干式转移法。
3. 阻断：在膜上加入一定浓度的蛋白质，以防止非特异性结合。
4. 探针抗体：将特异性的抗体与目标蛋白质结合，通常采用一一配对的方式进行。
5. 二级抗体：添加二级抗体，这种抗体能够与一级抗体结合，并携带着一定的标记物，用于可视化目标蛋白质。
6. 可视化：在化学反应中，标记物会通过某种方式将目标蛋白质可视化，例如酶联免疫吸附实验(ELISA)中的酶底物反应，或荧光素酶反应等。
蛋白质印迹技术因为其灵敏度高、可重复性好、操作简便等特点，被广泛应用于生物医学、生物学等领域。
同时，随着技术的不断进步，蛋白质印迹技术也在不断改进，例如多通量蛋白质印迹技术，能够同时检测多种蛋白质的存在和变化。
蛋白质免疫印迹实验在医学研究中的应用
蛋白质免疫印迹实验在医学研究中的应用
蛋白质免疫印迹实验是一种分析目标蛋白质在混合样品中的特异性和数量的方法。
它被广泛应用于医学研究领域，以下是一些应用：
1. 诊断疾病：免疫印迹技术可以用于检测不同疾病中的生化标志物，如心肌梗死、癌症和神经系统疾病。
2. 生物学研究：免疫印迹技术可以用于分析蛋白质的表达水平和分子量，研究基因调控、蛋白质解析和信号传递等生物学过程。
3. 新药研发：免疫印迹技术可以用于筛选和验证药物作用的靶点蛋白质，评估药物效果和不良反应。
4. 免疫学研究：免疫印迹技术可以用于研究免疫应答、炎症机制和免疫信号传导等方面的问题。
总之，蛋白质免疫印迹实验在医学研究中具有广泛的应用，它可以提供重要的生物学信息和临床诊断价值。
蛋白印迹法的基本过程
蛋白印迹法的基本过程什么是蛋白印迹法？蛋白印迹法（Western blotting）是一种用于检测特定蛋白质在样品中存在与否以及其相对丰度的实验方法。
它基于免疫学原理，通过将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并利用特异性抗体的结合来检测目标蛋白质的存在和浓度。
蛋白印迹法具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围，常用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域。
下面将介绍蛋白印迹法的基本过程，包括准备样品、电泳分离、转印、固定和检测等步骤。
1. 准备样品蛋白印迹法开始前需要从待检测的生物样品中提取蛋白质。
样品可以是细胞培养物、组织样本、血清或其他体液，根据不同研究目的选择不同样本类型。
提取蛋白质的方法可以采用细胞裂解或切碎组织等方法，以释放蛋白质。
在提取过程中，添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂等辅助试剂可保护蛋白质免受降解。
此外，还需对提取的蛋白质进行测定，以掌握蛋白质的总量。
2. SDS-PAGE电泳分离样品中提取到的蛋白质会在电泳分离中根据分子量（大小）被分离开来。
常用的电泳方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
首先，将样品混合物加入到聚丙烯酰胺凝胶的样品孔中。
电泳时，电场会使得蛋白质带电并向电极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质将被解离成线性状态，并获得相同的电荷密度。
蛋白质在电场作用下，由负极向正极迁移。
而根据蛋白质分子量的不同，迁移速度也不同，从而实现了蛋白质的分离。
3. 转印转印（blotting）是将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到含有蛋白吸附性纸膜的固相材料上的过程。
这个步骤是为了方便后续的特异性抗体结合和信号检测。
转印分为湿法转印和半干法转印两种方法。
湿法转印需要将蛋白分离凝胶与固相材料（通常是尼龙膜或聚乙烯膜）浸泡在缓冲溶液中，然后通过电流使蛋白质从凝胶中转移到固相材料上。
半干法转印采用蛋白质毛细作用实现分离凝胶与固相材料之间的转接。
4. 固定转印完成后，需要对蛋白质进行固定以防止其在后续步骤中的流失。
蛋白质免疫印迹的原理
蛋白质免疫印迹的原理蛋白质免疫印迹是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质在混合物中的存在并确定其分子量。
该技术基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理，通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。
蛋白质免疫印迹技术需要获取感兴趣的蛋白质样本。
这些样本可以来自细胞、组织、血清等。
通常，需要先对样本进行蛋白质提取和纯化，以获得高质量的蛋白质样本。
接下来，将蛋白质样本进行电泳分离。
常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2-DE）。
通过电泳分离，可以将蛋白质样本按照其分子量和电荷大小进行分离。
分离完成后，将电泳胶中的蛋白质转移到固定膜上。
这通常通过半湿式或干式转移的方法实现。
在半湿式转移中，将电泳胶和膜以间隔层叠放置，通过电流将蛋白质从胶体转移到膜上。
在干式转移中，将电泳胶和膜分开，使用特定的设备将蛋白质转移到膜上。
转移完成后，膜上的蛋白质被固定在膜上，形成蛋白质膜。
为了防止非特异性结合，膜上的蛋白质被处理成一定的条件，如用乙酸酐等进行酰化处理。
这样可以增加膜上蛋白质与抗体之间的特异性结合。
接下来，将蛋白质膜进行免疫染色。
首先，在蛋白质膜上加入特异性抗体。
这些抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，用荧光标记的或酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。
这些二抗可以识别并结合一定类型的抗体，从而实现对蛋白质的检测和定量。
使用相应的检测方法观察和分析蛋白质的存在与性质。
常用的检测方法包括荧光成像、放射免疫测定和酶联免疫测定。
这些方法可以通过测量光信号、放射性信号或酶反应产物的生成来确定目标蛋白质的存在与性质。
总结起来，蛋白质免疫印迹技术是一种基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理的实验技术。
通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，对于研究蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验是一种常用的生物化学实验，用于研究蛋白质
的结构和功能。
下面将介绍一般的蛋白质印记实验流程。
1. 提取蛋白质样品，首先需要从细胞或组织中提取蛋白质样品。
这可以通过细胞裂解和离心来实现。
裂解后的细胞溶液中含有各种
蛋白质，可以用于后续的实验操作。
2. SDS-PAGE电泳，将提取的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶
电泳（SDS-PAGE）凝胶槽中，通过电泳分离蛋白质。
SDS-PAGE可以
根据蛋白质的分子量将蛋白质分离成不同的条带，方便后续的实验
操作。
3. 转印，将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺
膜上，这个步骤称为印迹。
通过印迹，可以将蛋白质从凝胶中转移
到膜上，便于后续的免疫检测。
4. 免疫检测，在印迹膜上进行免疫检测，通常使用特异性抗体
与目标蛋白质结合，然后通过化学发光或染色等方法来检测蛋白质
的存在和含量。
5. 分析和图像，最后，通过分析免疫检测的结果，可以得到目标蛋白质的信息，包括其分子量、含量和可能的修饰情况。
通常会使用影像系统拍摄印迹膜的图像，以便于后续的数据分析和记录。
以上就是一般的蛋白质印记实验流程，通过这些步骤可以对特定蛋白质进行检测和分析，为后续的研究提供重要的信息。
蛋白质分子印迹技术
蛋白质分子印迹技术引言蛋白质分子印迹技术是一种重要的生物化学分析方法，被广泛应用于药物筛选、蛋白质识别和生物传感器等领域。
本文将详细介绍蛋白质分子印迹技术的原理、方法以及应用，以及其在生物科学和医药领域的前景展望。
原理蛋白质分子印迹技术基于分子识别原理，通过制备具有特异性识别空间的合成聚合物，实现对目标蛋白质的高选择性捕获。
其原理可分为三个步骤：1.印迹聚合物的制备–选择合适的功能单体和交联剂，例如有机二烯酸酯和乙烯二胺。
–将目标蛋白质与功能单体和交联剂一起引发聚合反应，形成印迹聚合物。
–利用溶剂萃取或模板释放方法，将目标蛋白质从印迹聚合物中去除，得到空腔结构。
2.目标蛋白质的识别–将样品溶液与印迹聚合物接触，目标蛋白质会与印迹聚合物的空腔结构相互作用，并被固定在聚合物中。
–其他非目标蛋白质被洗脱，只有目标蛋白质被保留在印迹聚合物中。
–通过洗脱方法，将目标蛋白质从印迹聚合物中释放出来，完成识别过程。
3.识别效果的验证–通过酶活性分析、免疫技术等方法，验证印迹聚合物对目标蛋白质的选择性和特异性。
方法蛋白质分子印迹技术包括聚合物制备、识别和验证三个主要步骤，具体方法如下：1. 聚合物制备1.添加功能单体、交联剂和引发剂到反应体系中。
2.在适当的条件下引发聚合反应，使单体和交联剂聚合形成网状结构。
3.将目标蛋白质加入反应体系中，与聚合物发生相互作用。
4.通过洗涤和萃取等方法，将目标蛋白质从聚合物中去除。
2. 目标蛋白质的识别1.将印迹聚合物与样品溶液接触，使目标蛋白质进入聚合物的空腔结构中。
2.使用洗脱缓冲液去除非特异结合的蛋白质。
3.利用洗脱剂将目标蛋白质从聚合物中释放出来。
3. 识别效果的验证1.对印迹聚合物进行酶活性分析，验证其对目标蛋白质的选择性。
2.利用免疫技术检测印迹聚合物中目标蛋白质的含量。
3.与其他识别方法进行比较，评估蛋白质分子印迹技术的优势和应用价值。
应用蛋白质分子印迹技术在生物科学和医药领域有广泛的应用前景，以下是其中几个重要的应用领域：1. 药物筛选蛋白质分子印迹技术可用于筛选特定药物的靶蛋白质，加速药物研发过程。
蛋白印迹实验原理
蛋白印迹实验原理蛋白印迹实验是一种常用的生物化学实验方法，用于检测和鉴定蛋白质的存在和表达水平。
它基于特定的蛋白质与抗体的特异性结合，通过电泳、转膜、抗体探针和检测方法等步骤，实现对目标蛋白质的定性和定量分析。
蛋白印迹实验的基本步骤包括：样品制备、凝胶电泳、转膜、阻塞、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、洗涤、显色和成像等。
需要将待测样品经过适当的处理和提取，如细胞裂解、蛋白质提取等，得到纯化或部分纯化的蛋白质样品。
然后，将样品进行凝胶电泳分离，通常使用的是聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），根据蛋白质的分子量对其进行分离。
分离完成后，需要将蛋白质从凝胶转移到膜上，这个步骤称为转膜。
常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。
在湿式转膜中，将凝胶和膜分别浸泡在缓冲液中，并施加电流使蛋白质从凝胶向膜上转移。
在半干式转膜中，膜与凝胶之间放置吸水纸，通过电流和压力使蛋白质转移到膜上。
转膜完成后，需要对膜进行阻塞处理，以防止非特异性结合。
常用的阻塞剂包括牛血清白蛋白（BSA）、干奶粉等。
阻塞剂会覆盖膜上的空白位点，减少非特异性结合的可能。
接下来，将膜与目标蛋白的特异性抗体进行孵育，以实现抗原与抗体的特异性结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据需要选择合适的抗体。
一抗孵育完成后，通过洗涤的步骤去除未结合的一抗。
然后，将膜与与一抗来源宿主不同的二抗进行孵育，二抗通常是标记有酶或荧光染料的抗动物抗体。
二抗结合到一抗上形成复合物，通过洗涤的步骤去除未结合的二抗。
根据所使用的标记物的不同，可以选择适当的检测方法进行显色或荧光成像。
常用的检测方法有酶标记法、放射免疫法和荧光标记法等。
其中，酶标记法是最常用的方法，通过酶作用将底物转化为可见的色素，从而实现对蛋白质的定性和定量分析。
蛋白印迹实验的优点是可以针对特定蛋白质进行高灵敏度和高特异性的检测，同时也可以通过对不同样品的比较分析，了解蛋白质的表达水平和变化趋势。
它在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域有着广泛的应用。
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验流程
蛋白质印记实验是一种常用的生物化学技术，用于研究蛋白质
的结构、功能和相互作用。
下面将介绍一般的蛋白质印记实验流程。
1. 细胞培养和蛋白质提取。
首先，需要培养所需的细胞系，并收集细胞。
然后，用细胞裂
解液裂解细胞膜，释放蛋白质。
接着，通过超速离心将裂解液离心，以获得上清液中的蛋白质。
2. 免疫沉淀。
将待测蛋白质上清液与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，使用蛋白A/G琼脂糖或其他亲和层析介质进行免疫沉淀，将
抗原-抗体复合物沉淀下来。
3. SDS-PAGE电泳。
将免疫沉淀得到的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小进行分离，从而得到不同的蛋白质
条带。
4. 免疫印迹分析。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质迁移到聚丙烯膜或硝酸纤维膜上，形成蛋白质印记。
然后，使用特异性抗体结合目标蛋白质，通过化学发光或染色方法检测蛋白质印记。
5. 数据分析。
最后，根据免疫印迹结果，分析蛋白质的表达水平、分子量和相互作用等信息。
通过比较不同样品的免疫印迹结果，可以得出对蛋白质的定量和定性分析。
总结，蛋白质印记实验流程包括细胞培养和蛋白质提取、免疫沉淀、SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析和数据分析等步骤。
这一流程可以帮助研究人员深入了解蛋白质的结构和功能，为生物医学研究提供重要的实验数据。
蛋白印迹实验方法的原理和步骤
蛋白印迹实验，又被称为Western blot，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过这种实验方法，研究人员可以确定样品中是否含有特定蛋白质，以及其相对浓度。
这一方法在生物医学研究中被广泛应用，对于研究蛋白质结构、功能和相互作用具有重要意义。
本文将介绍蛋白印迹实验的原理和步骤，希望能够帮助读者对这一实验方法有更深入的了解。
一、蛋白印迹实验的原理蛋白印迹实验的原理基于蛋白质的分子量及电荷特性。
当蛋白质被电泳分离后，可以通过膜转移和特异性抗体结合的方式来检测目标蛋白。
其基本步骤包括蛋白电泳分离、膜转移、抗体结合和信号检测。
1. 蛋白电泳分离蛋白印迹实验首先需要对样品中的蛋白进行电泳分离。
这一步骤通过SDS-PAGE或其他电泳方法进行，将蛋白质按照分子量大小进行分离。
分离过程中，蛋白质会在凝胶中形成不同的泳动带，便于后续的检测和分析。
2. 膜转移分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这一步骤通常通过湿式膜转移或半干式膜转移进行，目的是将蛋白质牢固地转移到膜上，并保持其原有的位置关系和相对分子量大小。
3. 抗体结合蛋白转移至膜上后，需要与特异性抗体结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白的，并且标记有辅酶或发光物质，便于检测和定量分析。
抗体结合过程需要严格控制条件，确保特异性和灵敏度。
4. 信号检测最后一步是通过染色、荧光或化学发光的方式来检测抗体和蛋白的结合情况。
根据信号的强度和位置，可以确定目标蛋白的存在与否以及其相对浓度。
以上就是蛋白印迹实验的基本原理，下面将介绍蛋白印迹实验的具体步骤。
二、蛋白印迹实验的步骤1. 样品处理首先需要将研究样品进行处理，常见的处理方法包括蛋白溶解、沉淀和浓缩。
处理完毕后，样品中的蛋白质将变得易于电泳分离和检测。
2. 蛋白电泳将处理好的样品加载到SDS-PAGE凝胶上，进行蛋白电泳分离。
这一过程需要严格控制电场强度和时间，以确保蛋白质能够按照分子量大小进行有效分离。
3. 膜转移电泳分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白转移到膜上。
蛋白印记操作流程
蛋白印记操作流程
蛋白印记（WesternBlot）是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测和分析蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
以下是蛋白印记的基本操作流程：
样品制备：首先，从细胞或组织中提取蛋白质。
对于细胞样品，通常需要将细胞破碎并溶解在裂解液中。
对于组织样品，可能需要将组织切成小块并加入预冷的裂解液进行匀浆。
然后，通过离心去除细胞碎片或未溶解的组织残渣，收集上清液作为蛋白质样品。
蛋白质定量：接着，对提取的蛋白质进行定量。
这可以通过使用蛋白质定量试剂盒或分光光度计等方法来完成。
蛋白质定量的准确性对于后续的实验步骤至关重要。
SDS-PAGE电泳：将定量后的蛋白质样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在一定温度下预热。
然后，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
电泳过程中，蛋白质会根据其分子量大小在凝胶中分离。
转膜：电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜上。
这一步通常通过电泳或真空转移法完成。
免疫检测：转膜后，使用特定的抗体与膜上的蛋白质进行免疫反应。
这通常包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和再次洗涤等步骤。
一抗是针对目标蛋白质的特异性抗体，而二抗则是与一抗结合的标记抗体，用于后续的显色反应。
显色与结果分析：最后，通过显色反应（如化学发光或荧光检测）来可视化抗体与蛋白质的结合情况。
根据显色结果，可以分析目标蛋白质在样品中的表达水平和分布情况。
整个操作流程需要严格遵循实验规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，还需要注意实验过程中的安全事项，如佩戴防护眼镜和手套等。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质分子印迹技术
蛋白质分子印迹技术一、概述蛋白质分子印迹技术（Protein Molecular Imprinting Technology，PMIT）是一种利用特定的模板分子对蛋白质进行高度选择性识别和分离的技术。
该技术主要基于分子印迹理论，通过在聚合物中引入模板分子，形成与之互补的空穴结构，使得蛋白质能够高度选择性地被捕获和识别。
二、原理PMIT的基本原理是将模板分子与功能单体共聚合成聚合物，在其表面形成与模板分子互补的孔道结构。
这些孔道结构可以高度选择性地识别和捕获与之匹配的目标蛋白质。
在制备过程中，首先选择适当的功能单体和交联剂，并将它们溶解在适当的溶剂中。
然后加入目标蛋白质作为模板分子，并进行共聚合反应。
最后通过洗涤、干燥等步骤去除模板分子，得到具有高度选择性识别目标蛋白质能力的PMIT材料。
三、制备方法1.功能单体选择：根据目标蛋白质的特性选择合适的功能单体，如甲基丙烯酸甲酯（MMA）、二乙烯基苯（DVB）等。
2.交联剂选择：选择适当的交联剂可以增加PMIT材料的稳定性和选择性。
常用的交联剂有乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、甲基丙烯酸二羟乙酯（HEMA）等。
3.模板分子引入：将目标蛋白质加入到聚合物反应体系中，与功能单体共聚合形成孔道结构。
4.去除模板分子：通过洗涤、溶解等方法去除模板分子，得到具有高度选择性识别目标蛋白质能力的PMIT材料。
四、应用1.生物传感器：利用PMIT材料制备出的生物传感器可以快速、准确地检测特定蛋白质。
2.分离纯化：PMIT材料可以用于特定蛋白质的纯化和富集，具有较高的选择性和效率。
3.药物释放控制：将药物与PMIT材料复合后，可以实现对药物释放速率和位置的精确控制。
五、优点1.高度选择性：PMIT材料可以针对特定的蛋白质进行选择性识别和分离。
2.稳定性：PMIT材料具有较高的化学稳定性和机械强度，可以重复使用。
3.适用范围广：PMIT技术适用于多种蛋白质，可广泛应用于生物医学、食品安全等领域。
蛋白免疫印迹法原理及步骤
蛋白免疫印迹法原理及步骤蛋白免疫印迹法是一种常用的生物化学实验方法，用于检测蛋白质在复杂混合物中的存在和定量。
它基于蛋白质与特异抗体的特异性结合，通过多步骤的操作最终形成可视化的结果。
该方法主要包括以下步骤：1. 样品制备：首先，需要提取目标蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来实现。
提取的蛋白质样品需要经过浓缩和纯化步骤，以去除其他干扰物质。
2. SDS-PAGE电泳：接下来，将样品中的蛋白质进行分离，一种常用的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
在电泳过程中，蛋白质按照其分子量的大小进行迁移，从而分离出不同大小的蛋白质带。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到聚氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素膜上。
这一步骤可以通过湿式转膜或半干式转膜的方法来完成。
4. 阻断：在转膜后，需要使用一种阻断剂，如牛血清蛋白(BSA)或非脂奶粉，来封闭膜上的非特异性结合位点，以减少假阳性结果的产生。
5. 抗体结合：将目标蛋白质与特异性一抗进行孵育，使其结合在膜上。
特异性一抗可以是经过免疫动物制备的抗体，也可以是通过基因工程技术获得的单克隆抗体。
6. 洗涤：将膜进行多次洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质。
7. 二抗结合：加入与一抗源动物不同物种的次级抗体，即特异性二抗。
次级抗体通常与酶或荧光素等标记物结合，以便最终形成可视化结果。
8. 可视化：使用适当的底物，如酶联免疫吸附法(ELISA)中的显色底物或荧光染料，来观察免疫复合物的形成。
这样，目标蛋白质就会在膜上形成特异的带状条纹。
蛋白免疫印迹法通过特异性抗体的结合和可视化结果的形成，可以高效、准确地检测目标蛋白质的存在和定量。
它广泛应用于生物医学研究领域，为我们了解蛋白质功能和分子机制提供了重要的实验手段。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。
收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。
根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。
因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。
100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。
煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。
蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。
两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。
然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
《分子生物学实验》实验报告实验名称：蛋白印迹技术姓名：陈杰学号：3140104666序号：25同组同学：唐陈曦带教教师：刘伟俞萍实验日期：2015年9月29日目录1.原理 (3)1.1 Westen印迹技术 (3)1.2 RT-PCR (5)1.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE） (6)2.操作步骤 (6)2.1 安装垂直板型电泳装置 (6)2.2 凝胶的制备 (6)2.3 转膜 (8)2.4 封闭 (8)2.5 一抗反应 (8)2.6 洗涤 (9)2.7 二抗反应 (9)2.8 洗膜 (9)2.9 检测 (9)3.实验结果 (10)3.1 照片记录 (10)3.2 数据处理 (11)4.讨论 (12)1.原理1.1 Westen印迹技术蛋白质印迹技术又称免疫印迹技术和Western印迹技术(Western blotting)，是鉴别蛋白质的分子杂交技术。
Western blotting的原理是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。
且能保持电泳分离的蛋白质的相对位置不变（转膜装置和预染的标准相对分子质量蛋白的转膜结果见图8-2-5～5-2-7）。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影，可以检测电泳分离的某种特定蛋白成分的存在和含量。
该技术也广泛应用于检测某种蛋白的表达水平。
Western blotting实验过程主要有以下几个步骤：1、SDS-PAGE分离待检测的蛋白质；2、转膜：将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到膜上；3、封闭：即利用非反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域；4、抗体结合：即利用相应蛋白质的抗体（一抗）与待测蛋白质进行免疫结合，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；5、底物显色或放射自显影检测电泳分离的特异性目的蛋白的存在与否和含量。
Western blotting的转膜方式以电转移最为常用，固相载体主要有：硝酸纤维素薄膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。
硝酸纤维素薄膜结合蛋白的能力为100ug／cm2，综合性能较好，以往使用的人较多；尼龙膜结合蛋白质的能力较强(480ug/cm2)，有很高的灵敏度，但结合背景较高；PVDF-膜具有较好的结合蛋白质的能力（200ug/cm2），且能较牢固地结合蛋白质，该膜的机械性能和化学特性强，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇的脱色条件下也不会影响膜的结构，结合在膜上的蛋门质可以直接进行序列分析，具有较好的染色和检测的兼容性。
常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3’-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。
在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。
但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。
碱性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-引哚磷酸／氮蓝四唑(BCIP/NBT)在原位转变为深蓝色化合物。
这是利用二抗标记物进行的显色反应．是最早的Western blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。
该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。
ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现，或使用Luminometer检测。
溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。
发光液A 和B 在HRP 的催化作用下Luminol 与H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。
在激发过程中不需要消耗HRP ，HRP 只是起催化作用，所以只要HRP 没有降解失活，是可以重复加发光液进行观察的。
ECL 化学发光检测灵敏度高，可以检测pg 水平的目标蛋白。
Western blotting 示意图1.2 RT-PCRRT-PCR 是一种在转录水平上检测基因的方法。
首先提取组织或细胞中的总RNA ，然后以RNA （主要是mRNA ）为模板，以与RNA 3‘端互补的引物或Oligo-dT 在逆转录酶的作用下进行逆转录，生成cDNA 的第一条链。
然后以cDNA 3’端互补的引物以及与RNA 3‘端互补的引物组成引物对进行PCR 扩增，最后通过电泳来检测是否产生PCR 的扩增区带，判别目的基因是否表达。
为了避免由于RNA 的降解而导致阴性的实验结果，在进行RT-PCR 时要设立一个内参照（管家基因的表达），以避免出现假阴性结果。
同时内参照可以对基因表达的变化起到半定量的作用。
RT-PCR 技术灵敏性高，常用于检测细胞中是否表达了某种RNA ，是基因表达检测的方法之一。
抗原 一抗 生物素标记的二抗 ECL 发光试剂1.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）利用蛋白质的等电点和分子量的差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质分离开。
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重优点。
第一向电泳是等电聚焦，在细管中进行，蛋白质根据其等电点不同进行分离。
而后将凝胶从管中取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行第二向电泳。
在第二向电泳过程中，蛋白质依据其分子量大小进行分离。
由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。
2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术，是蛋白质组研究中最早的支撑技术之一。
在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离。
接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离。
用适当的染色技术显示被分离的蛋白。
2.操作步骤2.1 安装垂直板型电泳装置将玻璃板用蒸馏水洗净晾干。
把玻璃板在灌胶支架上固定好。
固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
2.2 凝胶的制备1. 分离胶的制备：在一个干净的小烧杯中，按下表所列的试剂用量配置。
根据室温来调节TEMED的加入量。
12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表3mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）1.25m L10% SDS 0.1mL ddH2O 4.0mL10% Ammonium persulfate 0.07m L2% TEMED 0.6mL将所配置的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用1000uL取液枪加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约1cm。
沿玻璃片内壁加一层异丙醇（用于隔绝空气，使胶面平整）。
凝胶配置过程要迅速，加速剂TEMED要在注胶前再加入，否则会提前凝结无法注胶。
注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。
2. 浓缩胶的制备：在另一干净的小烧杯中，按表配置浓缩胶，应根据室温来调节TEMED的加入量。
混匀后用细长头的滴管或1000uL取液枪将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至加满，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。
约30 min后凝胶聚合，再放置30min。
小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。
4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表L3mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）0.83m L10% SDS 0.1mL ddH2O 3.0mL10% Ammonium persulfate 0.05m L2% TEMED 0.3mL2.3 转膜戴上手套，取下电泳好的凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，立即放在3张转膜缓冲液浸湿的Whatman 3MM滤纸上，将电泳完毕的凝胶放放在滤纸上面。
盖上1张经甲醛激活的PVDF膜（用刀片切除多余的滤纸和滤膜，使其大小均与凝胶完全吻合）排除气泡后，盖上另3张同样处理的滤纸，排除气泡。
按照顺序：负极3层滤纸-凝胶-膜-3层滤纸-正极。
用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上。
90V 电压1h。
取下膜放入培养皿中加入立春红预染1min初步观察转膜结果．TBST淋洗保存。
(转膜后的PVDF膜晾干后可在4℃冰箱中保存1周。
）2.4 封闭电泳结束后取下PVDF膜，用TBST淋洗后加入封闭液，室温摇床轻摇1-3h，2.5 一抗反应取出PVDF膜，用TBST淋洗，放入含1：10000稀释的一抗溶液中（用TBST稀释）室温至少1h或者4℃过夜。
2.6 洗涤回收一抗放置4℃保存（必要时加入叠氮钠防霉）．用l×TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min．2.7 二抗反应PVDF膜放入1：3000倍稀释的HRP标记的第二抗体溶液中（用TBST稀释），置温室摇床1h。
2.8 洗膜1×TBST洗涤3次，每次10min．2.9 检测将PVDF膜上加ECL化学发光液（A、B准备0.5mL等量混合，可直接加在PVDF 膜上），反应5min后在化学发光检测仪上观察并记录实验结果。
3.实验结果3.1 照片记录3.2数据处理最后加ECL化学发光液（这一步是老师操作，为节约时间三组一起进行），其中第一组是我们组的可以观察到我们组（25号26号）的二号框中，左侧部分约为右侧部分粗细的1.5倍，与浓度比1.5：1相符合。
4.讨论根据实验结果，可以看到一号框与二号框内总体结果较好，条带粗细的比例与加样浓度比例相符，其中三号框（别的组的条带）几乎没有条带，分析应该有这几种可能性：1、一抗和二抗失效；2、一抗与二抗不匹配；3、ECL液失效；4、抗体染色不充分；5、被测样品中不含有目的蛋白质或者目的蛋白质含量太低；6、溶液中有二抗标记物的抑制剂；7、抗体活力降低；8、转膜时未充分接触。
由于实验的材料三号框他们组和我们组所用材料是一样的，所以排除了可能性1、2、3，又由于在实验二（本次是实验三）中他们组没有出问题，所以排除了可能性5，则根据具体情况，我想可能性7和8的概率更大，应该是抗体拿出来之后离开冰浴时间太久。
可以更换抗体重新再做一次，判断实验结果。
或者直接不变条件重新操作，看是否是因为转膜的问题。
而四号框的情况，明显有气泡，另外就是条带特别粗，又连在了一起，我想可能是加样量很多或者是发光液加的过多。
可是试一试用PBST洗膜20min，期间换2次液。
再看是否变正常一点。
而为了避免有气泡，玻璃板一定要洗干净，用酒精洗干净之后再用双蒸水冲，再晾干。