共聚焦原理及操作
扫描共聚焦显微镜原理及应用
扫描共聚焦显微镜原理及应用共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它基于共聚焦原理实现了3D成像和光学切片功能。
本文将详细介绍共聚焦显微镜的原理以及主要应用领域。
共聚焦原理：共聚焦显微镜利用一束激光聚焦在样本上的一个点，只有这个点的荧光被激发并产生信号。
聚焦的点通过镜片的调整可以在三个维度上移动，从而扫描整个样品。
通过在激发激光束和荧光检测光之间放置一个光阑（pinhole），可以选择性地接收只来自焦点附近的光信号，从而去除来自样本其他区域的光信号。
这样，只有聚焦点的荧光信号被接收，实现了光学切片和3D成像。
共聚焦显微镜的应用：1.生物医学研究：CLSM广泛用于生物医学研究中，可以观察和研究单个细胞的形态、结构和功能。
例如，可以观察细胞器的分布和运动，研究细胞内信号传导通路的活动，以及探究生物分子的相互作用和交换。
2.神经科学：共聚焦显微镜广泛应用于神经科学研究中，可以观察活体神经元的形态和连接方式，研究神经元之间的相互作用以及突触的形成和重塑过程。
通过使用荧光标记的分子，可以研究神经元的突触传递和神经递质释放过程等。
3.细胞生物学：CLSM可以研究细胞分裂、增殖和凋亡过程，观察细胞的内部结构和细胞器，以及细胞内的动态过程。
还可以研究细胞与其周围环境的相互作用，例如细胞表面蛋白的分布和聚集。
4.药物研发：共聚焦显微镜可以用于药物研发过程中的细胞活性和药效评估。
通过观察和分析细胞中的信号通路活性和细胞的生理反应，可以评估药物的效果和毒性。
5.材料科学：共聚焦显微镜可以用于材料表面和界面的观察，以及材料的纳米结构和形貌的研究。
它在材料科学领域有着广泛的应用，例如纳米颗粒的制备和性能评估，纳米材料的光学和电学性质的研究等。
总结：共聚焦显微镜作为一种高分辨率的显微镜技术，通过共聚焦原理实现了3D成像和光学切片功能。
它在生物医学、神经科学、细胞生物学、药物研发和材料科学等领域有着广泛的应用。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
共聚焦显微技术基本原理
共聚焦显微技术基本原理
共聚焦显微技术是一种非常重要和常用的显微技术，它在生物学、医学和材料科学等
领域有着广泛的应用。
该技术通过聚光镜的特殊设计和精确的光学系统，能够对样品进行
高分辨率的成像。
共聚焦显微技术的基本原理可以概括为以下几个步骤：
1. 激光光源：共聚焦显微技术使用激光作为光源。
激光光源产生的单一波长和高亮
度的光束可以准确地聚焦到样品上。
2. 聚光镜系统：该技术使用具有高放大倍数的物镜来聚焦激光光束。
常用的物镜具
有10-100倍的放大倍数，用于放大样品。
3. 光学探测系统：共聚焦显微技术使用光学探测系统来收集和分析样品散射或荧光
的信号。
荧光探测器可以测量样品发出的荧光信号，根据不同的荧光颜色对样品进行成
像。
4. 扫描系统：共聚焦显微技术通常配备一个扫描系统，可以沿着样品平面进行扫描。
扫描系统通过移动镜子或移动样品台来改变光束的方向，从而实现样品的全景扫描。
5. 成像处理：成像处理是共聚焦显微技术的关键步骤之一。
通过计算机软件处理样
品的成像数据，可以创建高分辨率的三维图像和横截面图像。
共聚焦显微技术通过聚光镜系统、光学探测系统、扫描系统和成像处理等步骤，能够
实现样品的高分辨率成像。
这种技术的发展和应用为科学研究和实验提供了有力的工具。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
共聚焦原理及操作
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
共聚焦的原理和应用是什么
共聚焦的原理和应用是什么1. 共聚焦原理共焦显微镜（confocal microscopy）是由澳大利亚物理学家Minsky于1955年提出的一种新型显微镜技术。
它通过单个点的照射和探测，有效地降低了背景噪声，提高了图像的空间分辨率。
共焦显微镜利用点光源和反射镜进行扫描，在光的聚焦和扫描过程中通过孔径控制来排除掉除焦平面外的光，将真实的焦点信息转化为高质量的图像。
共焦显微镜的工作原理可以分为光源系统、荧光探测系统和扫描装置三个部分。
•光源系统：常见的共焦显微镜光源主要有白光光源、激光光源和LED光源。
光源系统提供高质量、稳定的光源，为荧光显微镜提供强光照明。
•荧光探测系统：荧光探测器用于检测样本激发后发出的荧光信号。
常见的荧光探测器有光电二极管（photomultiplier tubes，PMT）和光电倍增管（avalanche photodiode，APD）。
•扫描设备：扫描设备主要包括物镜组件、扫描镜组件和侦测系统。
其中，物镜组件主要用于调焦和聚焦光束，扫描镜组件用于控制束点的位置，侦测系统用于收集和记录样本发出的荧光信号。
2. 共聚焦应用共焦显微镜作为一种高分辨率的显微成像技术，被广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域，为科研人员提供了更准确、清晰的样本图像。
2.1 生物学应用共焦显微镜在生物学研究中的应用非常广泛。
它可以用于细胞观察、染色体分析、蛋白质定位等研究领域。
•细胞观察：共焦显微镜可以观察到细胞的形态结构、内部器官以及细胞分裂等细胞生物学过程。
•染色体分析：通过染色体荧光探针标记，可以对染色体结构和组织的分布进行观察和分析。
•蛋白质定位：共焦显微镜结合荧光染料可以实现对蛋白质的定位和跟踪，进一步研究蛋白质功能和相互作用。
2.2 医学应用共焦显微镜在医学领域具有重要的应用价值。
它可以用于医学诊断、药物研发和真菌感染等研究。
•医学诊断：共焦显微镜结合荧光探针可以对疾病的早期诊断和治疗提供重要的依据。
扫描共聚焦显微镜原理
扫描共聚焦显微镜原理一、引言扫描共聚焦显微镜（Scanning Confocal Microscope，SCM）是一种先进的显微成像技术，它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。
与传统的显微镜相比，扫描共聚焦显微镜具有更高的分辨率和更好的成像质量。
本文将重点介绍扫描共聚焦显微镜的工作原理。
二、扫描共聚焦显微镜的工作原理扫描共聚焦显微镜的基本原理是通过逐点扫描样品，并对每个像素点的荧光信号进行检测和记录，从而获得高分辨率的图像。
以下是扫描共聚焦显微镜的工作原理：1.逐点扫描：扫描共聚焦显微镜使用快速振镜或声光器件等扫描装置，对样品进行逐点扫描。
在每个像素点上，激光束聚焦在样品上，激发荧光。
2.激发荧光：当激光束照射到样品上时，会激发荧光。
这些荧光信号是样品特性的反映，可以用于成像。
3.检测荧光信号：在每个像素点上，荧光信号被检测器收集并转换为电信号。
这个过程是在焦平面上完成的，因此每个像素点都有良好的焦深。
4.记录图像：电信号被记录并转换为数字信号，然后通过计算机进行图像处理和显示。
由于每个像素点的荧光信号都被独立记录，因此最终获得的图像具有高分辨率和高对比度。
5.图像重建：通过将所有像素点的图像信息组合起来，可以重建出整个样品的图像。
这个过程可以通过计算机软件实现。
三、扫描共聚焦显微镜的特点和优势扫描共聚焦显微镜具有以下特点和优势：1.高分辨率：由于逐点扫描和独立检测每个像素点的荧光信号，扫描共聚焦显微镜可以获得高分辨率的图像，远高于传统的显微镜。
2.更好的焦深：由于在焦平面上进行检测，每个像素点都有良好的焦深，使得获得的图像具有更好的立体感。
3.减少杂散光干扰：通过只检测焦平面的荧光信号，扫描共聚焦显微镜有效地减少了杂散光干扰，提高了图像的对比度。
4.定量分析：由于每个像素点的荧光信号都可以独立记录，因此可以对样品进行定量分析，如测量荧光强度、测量荧光光谱等。
5.适合各种样品：扫描共聚焦显微镜适用于各种样品，如生物切片、细胞培养物、组织样本等。
细胞激光共聚焦实验报告
一、实验目的1. 了解激光共聚焦显微镜的基本原理和操作方法。
2. 掌握细胞激光共聚焦实验的步骤和注意事项。
3. 通过实验观察细胞内部结构，加深对细胞生物学知识的理解。
二、实验原理激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）是一种利用激光束扫描样品，并通过共聚焦成像原理获得高分辨率、高对比度图像的显微镜。
其基本原理是利用激光束经照明针孔形成点光源，对样品进行逐点扫描，然后通过探测针孔收集反射光，最终形成共聚焦图像。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞爬片、荧光染料（如DAPI、FITC等）、激光共聚焦显微镜、细胞培养箱、超净工作台等。
2. 实验仪器：激光共聚焦显微镜、荧光显微镜、图像采集系统、计算机等。
四、实验步骤1. 细胞爬片制备：将细胞培养于载玻片上，待细胞生长至一定密度后，用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，并固定封片。
2. 染色：将固定封片置于荧光显微镜下，用荧光染料对细胞进行染色。
本实验采用DAPI染色细胞核，FITC染色细胞质。
3. 共聚焦显微镜操作：将染色后的细胞爬片置于共聚焦显微镜载物台上，调整物镜焦距，使样品聚焦。
4. 图像采集：设置合适的激光波长和光圈，调整曝光时间，进行图像采集。
5. 图像分析：利用图像采集系统对采集到的图像进行处理和分析，观察细胞内部结构。
五、实验结果与分析1. 细胞核与细胞质的荧光分布：通过共聚焦显微镜观察到，DAPI染色的细胞核呈蓝色荧光，FITC染色的细胞质呈绿色荧光。
结果显示细胞核位于细胞中央，细胞质分布在细胞核周围。
2. 细胞内部结构：通过共聚焦显微镜观察，发现细胞内部存在线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，这些细胞器在荧光图像中呈现不同的颜色。
3. 细胞形态：通过共聚焦显微镜观察，发现细胞形态规则，呈椭圆形。
六、实验结论本次实验成功利用激光共聚焦显微镜观察了细胞内部结构，获得了高分辨率、高对比度的图像。
共聚焦制片方法
共聚焦制片方法共聚焦制片方法是一种在生物学和医学领域中广泛使用的技术，主要用于制作高分辨率、三维的样品图像。
其基本原理是利用激光束扫描样品，同时收集每个点的荧光信号，并通过对这些信号的精确分析，生成样品的三维图像。
下面将详细介绍共聚焦制片方法的基本原理、操作步骤和优缺点。
一、基本原理共聚焦制片方法基于共聚焦显微镜的原理，通过将激光束聚焦在样品上的某一特定点，激发该点的荧光。
然后收集该点的荧光信号，并将其传递给光电倍增管（PMT）进行检测。
由于激光束的聚焦点非常小，因此可以获得高分辨率的图像。
同时，通过对样品进行扫描，可以得到整个样品的图像。
二、操作步骤1.样品准备：选择适当的固定剂和染料，将样品固定在载玻片上，并进行染色。
2.扫描步骤：将样品放置在共聚焦显微镜下，调整焦距和光源，启动扫描程序。
扫描过程中，激光束会逐点扫描样品，同时收集每个点的荧光信号。
3.图像重建：通过对收集到的荧光信号进行分析和处理，可以重建出样品的三维图像。
三、优缺点1.优点：共聚焦制片方法具有高分辨率、高灵敏度和高轴向分辨率等优点。
它能够清晰地呈现出样品的细节和结构，适用于各种不同类型的样品，如细胞、组织、蛋白质等。
此外，共聚焦制片方法还可以进行多通道检测和定量分析，为研究提供了更多的信息。
2.缺点：共聚焦制片方法也存在一些缺点。
首先，由于激光束的聚焦点很小，因此需要逐点扫描样品，这使得扫描速度较慢。
其次，由于需要使用激光束和光电倍增管等昂贵的设备，因此共聚焦制片方法的成本较高。
此外，操作共聚焦显微镜需要一定的专业技能和经验，这也增加了使用难度。
最后，由于样品需要经过固定和染色等处理，可能会对样品的结构和活性产生影响。
四、应用领域共聚焦制片方法在生物学、医学、材料科学等领域中得到了广泛应用。
例如，在生物学中可以用于研究细胞结构和功能；在医学中可以用于诊断和治疗各种疾病；在材料科学中可以用于研究材料的微观结构和性能。
此外，共聚焦制片方法还可以用于制备高质量的荧光图像，用于科学研究、临床诊断和工业生产等领域。
共聚焦显微镜原理及其应用
共聚焦显微镜原理及其应用传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
共聚焦显微镜的应用。
细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。
共聚焦基本原理以及应用
4
Stokes频移
荧光 (发射光)
5
荧光显微镜
落射式
6
普通荧光和共聚焦图像对比
WF
小鼠脑片 胶质纤维酸性蛋白 神经纤维丝蛋白 细胞核
大鼠平滑肌 肌动蛋白 糖蛋白 细胞核
Confocal
向日葵花粉粒 自发荧光
7
荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 激光扫描共聚焦显微镜成像特点
42
能量共振转移（FRET）
方法一：受体漂白法（Acceptor Photobleach）
Donor pre-bleach
Donor post-bleach
Donor post-bleach – Donor pre-bleach
Efficiency =
Donorpost-bleach – Donorpre-bleach Donorpost-bleach
» 薄层光学切片 » ZOOM成像 » 多通道/光谱 » 多维度成像
激光扫描共聚焦的应用
共聚焦系统设计原理
共聚焦针孔 (Pinhole)
8
光电倍增管 (PMT) 荧光滤光片 (发射光滤色片)
激光
物镜 标本
眼睛观察
CCD 取图
9
Confocal 图像
Confocal Laser Scanning Microscope
激光扫描共聚焦显微镜 基本原理及应用
奥林巴斯（中国）有限公司 袁振环 2012.5.8
2
荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 激光扫描共聚焦显微镜成像特点
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激光扫描共聚焦的应用
高温激光共聚焦升温速度
高温激光共聚焦升温速度1. 介绍高温激光共聚焦（High-Temperature Laser-Induced Co-Focusing, HT-LICF）是一种用于快速加热材料的技术。
通过将多个激光束聚焦在一个点上，可以实现对材料的快速加热，从而控制温度和加热速度。
高温激光共聚焦升温速度是指在高温激光共聚焦过程中，材料的温度升高的速度。
本文将介绍高温激光共聚焦的原理、应用领域以及影响高温激光共聚焦升温速度的因素。
同时，将探讨如何优化实验条件以提高升温速度，并提供相关实验技术和技巧。
2. 高温激光共聚焦原理高温激光共聚焦原理是将多个高能激光束聚焦在一个点上，通过吸收辐射能将能量传递到材料中，使其温度快速升高。
主要包括以下步骤：•聚焦：使用透镜或反射镜将多个激光束聚焦到一个小点上，形成高能量密度区域。
•吸收：材料中的吸收器（通常为颗粒）吸收激光束的能量。
•热传导：吸收的能量传导到材料周围，引起材料局部区域的升温。
•热扩散：热量从局部区域向材料内部扩散，使整个材料温度升高。
通过调整激光束的参数和聚焦条件可以控制激光共聚焦升温速度，从而实现对材料的快速加热。
3. 应用领域高温激光共聚焦技术在多个领域中得到广泛应用，包括材料科学、生物医学、能源等。
3.1 材料科学在材料科学领域，高温激光共聚焦可以用于材料表面改性、材料合成和材料性能改进等方面的研究。
通过控制升温速度和温度梯度，可以实现对材料微观结构和性能的精确调控。
3.2 生物医学在生物医学领域，高温激光共聚焦可以用于细胞精确加热和组织热疗等研究。
通过调控激光共聚焦的参数，可以实现对细胞和组织的选择性损伤，从而用于癌症治疗和疾病治疗等应用。
3.3 能源在能源领域，高温激光共聚焦可以用于太阳能电池和电池材料的研发。
通过快速加热材料，可以实现对太阳能电池和电池材料的性能的改进，提高转换效率和电池寿命。
4. 影响高温激光共聚焦升温速度的因素高温激光共聚焦升温速度受多个因素的影响。
激光共聚焦原理
激光共聚焦原理激光共聚焦（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，通过利用激光束的特殊聚焦方式，可以获取高质量的三维显微图像。
激光共聚焦显微镜的原理是基于激光束的共聚焦特性，实现对样品的逐点扫描和成像。
激光共聚焦显微镜的核心部件是激光光源、聚焦物镜、光路分束器、探测器和图像处理系统。
激光光源可以是氩离子激光器、固体激光器或半导体激光器，其发出的激光束具有高度的单色性和方向性。
聚焦物镜是将激光束聚焦到样品上的关键部件，它能够实现高倍率的放大和高分辨率的成像。
光路分束器用于将激光束分为两个光路，一个用于样品的照明，另一个用于信号的探测。
探测器可以是光电二极管、光电倍增管或光电子多线阵列等，用于接收样品散射或荧光发射的光信号。
图像处理系统则将探测到的信号转化为数字图像，并进行图像增强、三维重建等处理。
激光共聚焦显微镜的原理可以用以下步骤来描述：1. 激光照明：激光光源发出的激光束通过光路分束器，其中一部分激光束照射到样品上。
2. 聚焦成像：经过聚焦物镜的调节，激光束被聚焦到样品的一个小点上。
由于激光束的高度单色性和方向性，聚焦后的光点非常亮且细小，使得可以获得高分辨率的显微图像。
3. 光信号收集：样品中的物质对激光束的照射会发生散射或荧光发射，这些光信号被探测器收集并转化为电信号。
4. 光路控制：光路分束器将探测到的光信号分为透射光和反射光，透射光通过探测器后被丢弃，而反射光则被送入图像处理系统。
5. 图像处理：图像处理系统将反射光信号转化为数字图像，并进行图像增强和三维重建等处理，最终得到高质量的三维显微图像。
激光共聚焦显微镜在生物学、医学、材料科学等领域具有广泛的应用。
其高分辨率和三维成像能力使得研究者可以观察到细胞内部的微观结构和细胞器的分布情况，进一步研究细胞的功能和变化。
同时，激光共聚焦显微镜还可以应用于材料表面的显微观察和纳米尺度的结构分析，为材料科学的研究提供了重要的工具。
激光共聚焦原理
激光共聚焦原理激光共聚焦（LSCM）是一种高分辨率的显微成像技术，它利用激光束的聚焦和激发样品上的荧光来获取高质量的细胞和组织图像。
激光共聚焦显微镜在生物医学研究、材料科学、纳米技术等领域有着广泛的应用。
了解激光共聚焦原理对于正确操作和应用这一技术具有重要意义。
激光共聚焦原理的核心是激光聚焦和荧光成像。
首先，激光束通过透镜系统进行聚焦，使得激光光斑在样品表面聚焦成一个极小的光点。
这个光点的直径通常在几百纳米到几微米之间，这取决于激光束的波长和透镜的数值孔径。
激光光斑的极小尺寸使得激光共聚焦显微镜能够获得高分辨率的图像，这是传统荧光显微镜无法比拟的优势。
其次，激光共聚焦显微镜利用激光激发样品上的荧光来获取图像。
在样品中加入荧光染料后，激光束照射到样品表面会激发荧光染料的荧光发射。
荧光信号经过物镜和光学滤波器系统后被检测器捕获，最终转化成数字信号并形成图像。
由于激光光斑的极小尺寸，激光共聚焦显微镜在获取图像时能够减少背景噪音和提高信噪比，从而获得更清晰、更真实的图像。
除了激光聚焦和荧光成像，激光共聚焦显微镜还具有光学切片和三维成像的能力。
通过调节激光束的焦深，激光共聚焦显微镜可以在样品内部进行光学切片，获取样品内部不同深度的图像。
这种能力在生物医学研究中尤为重要，可以观察样品内部的微观结构和细胞器的三维分布。
同时，激光共聚焦显微镜还可以进行时间序列成像，实现样品在不同时间点的三维成像，从而观察样品的动态变化过程。
总的来说，激光共聚焦原理是基于激光聚焦和荧光成像的技术，通过激光束的聚焦和激发样品上的荧光来获取高分辨率、高对比度的图像。
激光共聚焦显微镜具有高分辨率、低背景噪音、光学切片和三维成像的能力，因此在生物医学研究、材料科学、纳米技术等领域有着广泛的应用前景。
对激光共聚焦原理的深入理解，有助于科研人员更好地应用这一技术，从而推动相关领域的发展和进步。
尼康共聚焦显微镜使用手册
尼康共聚焦显微镜使用手册一、基本介绍尼康共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，采用共焦原理，可以实现高分辨率成像和三维重建。
本手册将向您介绍共聚焦显微镜的基本原理、使用方法、操作技巧及注意事项，帮助您更好地使用尼康共聚焦显微镜进行科研工作。
二、原理介绍1、共焦原理共焦显微镜利用共焦原理，通过共焦点成像来获得样品的高分辨率、高对比度的图像。
通过调节激光光源和样品之间的焦平面，可以获得样品内部的三维结构信息。
2、激光扫描共聚焦显微镜采用激光扫描技术，可以在样品表面进行二维或三维扫描，获得高分辨率的图像，同时可以进行光刻、光化学反应等操作。
三、使用指南1、准备工作（1）打开设备电源，确保设备正常工作。
（2）检查激光器和探测器是否正常，如发现异常要及时报修或更换。
2、样品准备（1）样品应固定在样品台上，并使用减震支架减少震动干扰。
（2）样品表面应保持干净，避免灰尘或杂质影响成像质量。
3、激光扫描和成像（1）设置激光功率、扫描速度和放大倍数，确保获取清晰的图像。
（2）确保样品与镜头之间的距离和焦点合适。
（3）根据需要进行二维或三维扫描，获取所需的成像数据。
四、操作技巧1、焦点调节在进行成像过程中，根据样品的不同厚度和形状，需要不断调节焦距，确保获取清晰的图像。
2、参数设置根据实际需要，灵活调整激光功率、扫描速度、放大倍数等参数，以获得最佳的成像效果。
3、数据处理共聚焦显微镜拥有强大的成像和数据处理功能，可以进行三维重建、虚拟切片等操作，因此在获取原始数据后，要熟练使用相应的软件对数据进行处理。
五、注意事项1、使用过程中要注意激光辐射对眼睛的伤害，使用时要佩戴防护眼镜。
2、使用完毕后，及时关闭设备电源，清理样品台和激光扫描头部的杂质。
3、定期维护显微镜设备，保持设备的清洁和稳定。
总结：尼康共聚焦显微镜是一种高端的显微镜设备，应用广泛，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。
通过本手册的介绍，相信您对共聚焦显微镜的使用有了更深入的了解，希望能够帮助您更好地进行科研工作。
共聚焦显微镜工作原理
共聚焦显微镜工作原理
哎呀，说起共聚焦显微镜，这玩意儿可真是个神奇的东西。
记得我第一次见它的时候，我还以为是个什么高级的玩具呢，结果一问才知道，这可是科学家们用来观察细胞和组织的工具。
话说回来，共聚焦显微镜的工作原理，其实就像是在玩一个非常精细的拼图游戏。
想象一下，你手里有一堆小小的、颜色各异的拼图块，你得把它们拼在一起，才能看到完整的画面。
共聚焦显微镜也是这么回事，它用一束激光，就像是你的手电筒，照射在样品上，然后通过一个特殊的镜头，把那些反射回来的光线收集起来。
这镜头可不一般，它有两个孔，一个在前面，一个在后面。
前面的孔就像是个过滤器，只有那些和激光束对齐的光线才能通过，其他的都被挡住了。
这样一来，你就能看到一个非常清晰的图像，因为只有那些最精确的光线被允许通过。
然后，后面的孔就像是个门卫，它检查通过的光线，确保它们是来自样品的特定深度。
这样，你就可以一层一层地观察样品，就像是在翻书一样，一页一页地看。
我记得有一次，我在实验室里用共聚焦显微镜观察细胞，那感觉就像是在看一场无声的电影。
细胞里的每一个小东西都在动，有的在分裂，有的在吞噬，还有的在移动。
那画面清晰得就像是在看高清电视一样。
而且，共聚焦显微镜还能让你看到那些肉眼看不见的微小结构，比如细胞膜上的微小孔洞，或者是细胞内部的微小颗粒。
这些细节，如果没有共聚焦显微镜，我们可能永远都看不到。
总之，共聚焦显微镜就像是科学家们的超级放大镜，让他们能够看到那些我们平常看不到的微观世界。
虽然听起来挺复杂的，但用起来就像是在玩一个高级的拼图游戏，只不过拼图的块是细胞，拼图的结果是科学发现。
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一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i 的基本原理如图7.1所示。
图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。
Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。
具体过程如下：1 Ca2+荧光探针负载1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i1. Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。
测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
2. 取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
3. 将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
4. 测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为Rmax；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为Rmin。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i1. 对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+ 的荧光强度及分布变化，拍照。
2. 对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。
激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。
细胞内Ca2+ 荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线，再转换为时间~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。
为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)其中，Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；Rmax、Rmin分别为上述测定的最大和最小荧光比值；Fmin、Fmax分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。
实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]其中，Kd为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，Fmax、Fmin分别为加0.1% Triton X-100及5 mM EGTA 时测得的荧光强度值。
投票2 收藏9单个细胞也是一样的原理：细胞内Ca2+浓度测定需要的几个基本配套仪器：倒置荧光显微镜一台，CCD（信息采集系统，照相功能），POL YCHROME，MONOCHROMA TOR，加药系统一套，TILLVISION 处理软件一套，细胞内Ca2+结合荧光染料（我们也用FURO-2）计算机一套暗室当单个或培养的是少数细胞时操作如下：1.先将母液FURO-2配好（1MG/ML用荧光专用的DMSO溶解置-20度冻存备用）2.观察正常细胞形态3.打开所有仪器预热4.配孵育液（取1UL加到HANKSBUFFER 1ML中使其终浓度为1UMOL/ML）5.细胞清洗干净，然后将其放于孵育液中约半小时（可试情况加热37度）6.清洗细胞后换上新的孵育液以备加药用，此时置于浴槽中7.将显微镜的油镜滴上油8.将浴槽放于显微镜上9.先肉眼观察细胞细胞，将所要监测的细胞置于视野最中央10.将显微镜打到SP状态，镜头打到油镜11.打开软件，点击照相即可以观察到细胞其他的关于PROTOCOL的设置和数据处理就不用我罗嗦了吧整个实验的注意事项：1.所有的只要涉及到有FURO-2的步骤都要避光，从配液到孵育和整个的实验过程都要避光孵育时可以在外面罩上锡泊纸实验时要关掉所有光源2.荧光DMSO有毒性配置时要带手套3.肉眼看细胞时显微镜置于眼睛状态采集数据时打到SP状态光路才通这个没有什么难的，首先1.激光共聚焦镜样本制备常温下取所测细胞悬液于一次性塑料试管中。
将细胞悬液进行离心,1000r/min,每次10min。
反复清洗3次，吸出上清液后吹打混匀。
取50μl的细胞悬液，加入17μl的Fluo-2钙探针，放入36.5℃的水浴箱中温育40min。
取温育液1μl，滴片后拉片，迅速上机观察。
2.细胞内游离Ca离子浓度测定将负载有Fluo-2的细胞滴加在载玻片上后拉片，置激光共聚焦显微镜载物台上在荧光镜下观察细胞形态及负载情况，氩激光预扫描，设置扫描条件为激发波长480nm，发射波长530nm；扫描密度：1024×1024；Pinhole1.00,物镜放大倍数40×。
调节信噪比及焦聚在最佳状态时，以点扫描方式(2×6)扫描，将图像存盘，分析时重新读取。
分析软件我们用的是TCS-SP2型,根据荧光强度与钙离子浓度成正比，所以用平均荧光强度代表游离钙离子浓度。
要点：按此protocol操作基本上没有什么问题，一些参数可以根据实际仪器和情况作调整。
Fura－2/AM,测Ca离子浓度一．试剂配制：1．Hanks buffer 500ml:NACL 4.00 g KCL 0.20 g CACL2 0.07 g MgSO4 0.10 g NA2HPO4 0.03 g KH2PO4 0.03 g GLUOSE 0.5 g PHENOL RED 0.01 g，加500 ml超纯水，hepes 1.19g，调PH值7.4，过滤，4度冰箱保存。
10mM Hepes (PH 7.4)2．EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)标准滴定溶液（浓度=0. 1mol/L）配制称取3.8g乙二醇二乙醚二胺四乙酸（分子量＝３８０），置于200mL烧杯中，加约50mL水，低温加热，在不断搅拌下，滴加氢氧化钠溶液(至试剂溶解（ＰＨ值8.2，），冷却至室温。
移入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
水用纯净。
3．10%的TritonX-10300ul TritonX-100加3ml hanks ，混匀，冷藏备用。
4. Hanks buffer+BSA的制备Hanks buffer100ml 加100μl BSA(1g/ml)，震荡混匀。
5. 0.25mmol /L Fura－2/AM 储备液0.5mg Fura－2/AMf粉末溶于2ml DMSO 中，分装冷藏备用。
二．实验原理作为细胞内钙离子浓度测定的主要荧光染料有5中Quin-2，Indo-1，Fura-2，Fluo-3，Rhod-2。
它们均是钙离子的螯合剂EDTA的衍生物，有较好的量子产额并队钙有较强的特异性亲合力，这些荧光染料本身不能透过细胞膜进入细胞内，将它连接一个乙酰甲酯后宁可将染料导入细胞中，经细胞内的非特异性的酯酶水解该酯键，释放出染料分子。
三．实验方法1.细胞悬液的制备：将细胞以1*10^6个种入皿中，24小时后加药，加药48小时后用hanks buffer 洗两次，trypsin 消化，离心（1000rp,10分钟），洗1次，将细胞悬浮于1ml Hepes缓冲的HANKS+BSA液中，细胞计数后，使终浓度为1*10^6-10^7/ml，2.钙荧光的导入加入0.25mmol /L Fura－2/AM 20μl ，使Fura－2/AM浓度为5μmmol /L，加入细胞悬液中，37摄氏度培养箱里温育半小时。