乙肝病毒特性与致病机理研究进展

乙肝病毒特性与致病机理研究进展王晓冬，王峰，吕月蒙，李强，张国峰，孙涛，贾亚雄甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070）E-mail：wangxiaodong505@摘要：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝细胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲”。

新近有多项研究表明活化的T细胞反应可能在HBV感染的慢性化和肝细胞损伤过程中起重要作用。

CD4+Th细胞可分为Thl和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。

Thl细胞主要分泌IL-2, IFN- X和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，参与细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等细胞因子，参与体液免疫应答;Thl/Th2的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。

Thl与Th2之间存在相互制约或促进左右，细胞因子组成一个复杂的分子网络，参与调节炎症反应以及器官功能的自我稳定。

关键词：细胞因子，乙型肝炎病毒，细胞毒性T淋巴细胞1.引言乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）引起的。

HBV的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生、发展密切相关。

20﹪的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危险性是正常人的100倍。

HBV感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）携带率在2﹪以下；东欧、日本、南美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区（HBsAg 携带率10﹪左右）。

全世界共有约3.5亿人为HBsAg慢性携带者，其中3/4在亚洲。

HBV感染导致全球每年50～120万人死亡，其中死于HCC的约占32万。

我国是HBV感染的高发区，约60﹪的人群感染过HBV，10﹪的人群为携带者，多达1.2亿。

现有乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为158/10万[1-4]。

随着HBV 疫苗在1982年的问世，HBV感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。

但是，乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险，不幸的是，到目前为止，还没有针对HBV的特效药物。

因此，乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是医学研究的重大课题。

2.HBV的生物学特性2.1 HBV的生物学分类1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV划归为一个新的病毒科——嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）的成员。

该科病毒成员除了人HBV外还有：（1）东方土拨鼠肝炎病毒（GHV），1978年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发现该病毒。

东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV），是1980年在美国南加州的地松鼠中发现的；（3）鸭乙型肝炎病毒（DHBV），1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分离自易发生肝癌的麻鸭，后来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发现此病毒[5-6]。

2.2 HBV的形态与结构HBV在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗粒，电镜下观察HBV的提纯制品，证明有三种类型颗粒[7-9]。

1.小球型颗粒平均直径为22nm，由空心病毒包膜组成，是HBV多余的衣壳蛋白，没有病毒核酸。

无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具有中和病毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。

2.管型颗粒由小球型颗粒连接而成，其长短不一。

小球型颗粒和管型颗粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩。

小球型颗粒和管型颗粒与Dane颗粒的比例依不同的病程差异较大，一般撒Dane颗粒的10 4～108倍，在患者血液中的含量可高达 1013个/ml.3.Dane颗粒为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为42nm，由包膜和核衣壳组成。

核衣壳直径为27nm，含有HBcAg，单一分子的部分双链DNA以及依赖DNA的DNA聚合酶。

核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的保护性容器。

另一独特的特征是P蛋白与长DNA链共价结合。

在患者血液中的Dane颗粒含量为10 4～106个/ml.图一电子显微镜下可以观察到乙肝病毒3种不同的形态：大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒[10]图二肝病毒（HBV）结构示意图[10]2.3理化特性及抵抗力在氧化铯平衡梯度离心中，HBV颗粒（42nm）的浮力为1.22g/cm3.表面抗原颗粒（22 nm）为1.22g/cm3，病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的30%。

HBV对理化因素有较强的抵抗力。

病毒在30 ～ 32℃可存活至少6个月，在 -20 ℃可存活15年。

病毒浓度高时，60℃加热10h,或98℃加热1min,以及乙醚或pH2。

4处理均不能有效灭活乙肝病毒，能够灭活HBV的常用方法和条件包括121℃高压灭菌20min, 160℃干烤1h，100℃直接煮沸2min,以及0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的直接处理。

HBV的感染性并非与其抗原性和免疫原性相一致，在一些能够灭活HBV感染性的条件下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保留[11]。

2.4 HBV的基因组和蛋白组成HBV基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负（一）链为全长基因，约含3200个核苷酸，而正（+）链是负链长度的20～80%，病毒颗粒内含有DNA聚合酶。

在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链DNA病毒中，HBV基因组是最小但又是最高效的。

它具有以下4个鲜明的特点[12-14]：（1）不完全双链环状结构；（2）利用重叠的开放读码框（open reading frame ORF）编码多个蛋白质；（3）所有调控序列均位于蛋白质编码区内；（4）基因序列具有多变性。

图三HBV基因组基本结构[15]HBV含有4个ORF，即S区（包括preS1、preS2及S）、C区（包括preC和C）、P区和X 区[16]，ORF之间互相重叠。

HBV有4种转录子，共用一个PolyA加尾信号，长度分别为3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb（图）。

4种mRNA合成7种病毒蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白）、核壳蛋白（前C和C蛋白）、X蛋白和P蛋白[17]。

外膜蛋白由S基因区编码，包括3种外膜成分：主蛋白（small protein ,S protein, 即HBsAg）、中蛋白（middle protein ,M protein, 即preS2+HBsAg）和大蛋白（large protein ,L protein, 即preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在3种成分中含量最高。

主蛋白和中蛋白由2.1kbmRNA翻译而来，而大蛋白则是2.4kbmRNA的产物。

HBV的外膜蛋白构成病毒的外壳包裹颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞。

大蛋白在病毒与细胞受体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。

此外，外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能够刺激机体产生保护性免疫应答。

核壳蛋白由HBV基因组的C区编码，存在两种形式：核心抗原（HBcAg）和e抗原(HBeAg). HBcAg分子量21KD，是病毒核壳的组成成分，在病毒复制过程中负责对前基因组RNA包装，这是基因组复制的必备步骤。

HBcAg有较强的免疫原性，几乎所有的HBV 感染者均产生针对HBcAg的抗体。

HBeAg是分泌性蛋白，先由preC+C区编码带有信号肽的24KD的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基体被蛋白酶切割后形成16KD成熟分子进入病人的血液中，HBeAg可诱导机体产生相应的抗体，其功能尚不清楚。

HBcAg和HBeAg均是3.5kbmRNA的翻译产物。

P蛋白即聚合酶（polymerasa, Pol）由P基因区编码，是一个含816个氨基酸的大蛋白，也是3.5kbmRNA的翻译产物。

目前已经发现P蛋白具有4个功能性结构域，P蛋白参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作用。

HBV 前基因组RNA反转录过程中的几个关键步骤，包括RNA的包装、DNA合成所需的引物、以RNA和DNA为模板合成DNA以及将RNA-DNA杂交体中的RNA消化等，均涉及P蛋白的功能。

由于P蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要靶点。

X蛋白由X基因区编码，其转录子为0.7kbmRNA。

X蛋白具有多种功能。

它可反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调节序列，还可以激活蛋白激酶C，从而影响细胞信号转导。

病毒在体内复制和传播也需要X蛋白的参与[18-21]。

2.5 HBV的复制在HBV的复制过程中，最突出的特点是，作为DNA病毒，HBV不以DNA为模板进行复制，而是将DNA转录RNA中间体（RNA intermediate）或称前基因组RNA，再逆转录成DNA 进行复制，与逆转录病毒的复制过程类似。

HBV的复制过程有以下几个环节[22]：（1）侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜上的受体（至今不清楚）结合，脱去外壳核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒DNA及聚合酶进入细胞核；（2）修复：HBV聚合酶修复不完整的正链，使其与负链完全互补，形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, ccc DNA）,即超螺旋结构，是病毒复制的重要标志；（3）转录：宿主RNA聚合酶Ⅱ以ccc DNA为模板，转录出长短不一的mRAN,这些mRNA 分子从细胞核转移到细胞质；（4）复制： mRNA分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X和聚合酶等多种蛋白。

3.5kbmRNA被成为前基因组RNA（pregenomic RNA,pRNA）,含有病毒编码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是HBV基因组复制时反转录的模板。

在细胞质内，核心蛋白包裹pRNA和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复制即在其中进行：先由病毒自身的聚合酶以pRNA为模板，逆转录出负链DNA，pRNA被降解：再以负链为模板，合成正链DNA，形成部分双链的环状DNA，即成熟的病毒基因组；（5）循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持核内一定量的ccc DNA；（6）释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳，形成成熟的病毒颗粒释放到细胞外。