实验二 沉淀反应(2015修改)
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应(精)
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
现象
解释
思考题
1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 3.什么是蛋白质的等电点？ 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生
沉淀 ？
• 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测 定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的 等电点。
• 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体 颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白 质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变， 蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂 中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现 为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变 性。
蛋白质的沉淀反应可分为 两类。
可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变 化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析 作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间 作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此 类反应。
不可逆沉淀反应
实验二、蛋白质 等电点测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
沉淀反应实验报告-沉淀实验实验报告
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。
不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。
另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。
如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、ph试纸6、水浴锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。
此试剂可长期保存。
4、尿素晶体5、1%cuso：1g cuso晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 446、10%naoh：10g naoh溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤蛋白质的颜色反应（一）米伦（millon’s）反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。
实验二、沉淀反应
实验二沉淀反应一、实验目的1、了解沉淀的生成、溶解和沉淀的转化条件，掌握沉淀平衡，同离子效应以及溶度积原理。
2、学习离子分离操作和同离子效应和电动离心机的使用。
二、实验的内容1、沉淀的生成和溶解①查表得：PbI2的ksp为7.1×10-9取1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2+9d水，取1d+9d水，配成1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液取1d 0.1mol/L的kI+9d水，取其中1d+9d水，再取1d+1d 水+首先配好的1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液2d→不出现黄色沉淀，溶液无变化。
计算：Q=【pb2+】·【I-】2=25/8×10-11﹤ksp计算值也不应该有沉淀。
反应方程：pb2++ 2I-≒pbI2实验结论：1、计算结果与实际相符，Q﹤ksp，不出现沉淀2、没看到pbI2黄色沉淀，不等于不存在pbI2，溶液中还是存在少量的pbI2②查表得：pbs的ksp=8×10-28 pbcro4ksp=2.8×10-13取1d 0.1mol/L的Na2S+1d0.1mol/L的k2cro4,稀释至2.5mL 取1d上述溶液+1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2→有棕黄色的混合沉淀出现。
计算：Q﹙pbs﹚=【S2-】【pb2+】=4×10-6﹥其kspQ﹙pbcro4﹚=【S2-】【cro42-】=4×10-6﹥其ksp反应方程：pb2++ S2-≒pbs pb2++ cro42-≒pbcro4实验结论：只要Q﹥ksp，就会出现沉淀，在同一溶液中也不会因沉淀的ksp的大小而出现沉淀的先后，而是同时沉淀。
如随着某离子的加入，Q先达到某个沉淀的ksp，后达到另一个沉淀的ksp，这是才会出现沉淀的先后之分。
2、沉淀的溶解和转化1d 0.1mol/L Pb（NO3）2+2d 0.1mol/L NaCL→Pbcl2↓（白色）+2d 0.1mol/L kI溶液→pbI2↓(黄色) {离心，去掉上清液→稀释至0.5mL}+饱和Na2so4晶体→ pbso4↓(白色) +0.1mol/L k2cro4→pbcro4↓（黄色）+2~3d 0.1mol/L k2S→pbs↓(黑色) {离心，取上清液，颜色为粉红色}★查表得：ksp（Pbcl2）=1.6×10-5 ksp（pbI2）=7.1×10-9 ksp（pbso4）=1.6×10-8ksp（pbcro4）=2.8×10-13 ksp（pbs）=8×10-28★计算：例Pbcl2转化为pbI2的过程：Pbcl2+ 2I-≒pbI2+2cl-K°=【cl-】2/【I-】2=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【I-】2= ksp （Pbcl2）/ ksp（pbI2）=1.6/7.1×104K°值越大，沉淀转化的越完全，对同一类型的沉淀来说，溶度积越大的沉淀越易转化成溶度积小的沉淀对ksp小→ksp大的方向进行的特例：ksp（pbI2）/ ksp（pbso4）=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【so42-】推出→【so42-】min=0.16/7.1 因此Na2so4晶体或饱和Na2so4溶液满足此条件。
沉淀反应实验报告
沉淀反应实验报告实验目的：通过观察不同物质间的沉淀反应，了解沉淀反应的特点及其影响因素。
实验原理：沉淀反应是指在两种溶液混合时，由于生成了不溶于水的沉淀物而产生的化学反应。
在此类反应中，通常会发生离子之间的置换反应，生成不溶于水的沉淀。
沉淀反应的发生需要满足两种溶液中存在的阳离子和阴离子能够形成不溶于水的盐类化合物，这种反应通常在溶液中加入一种沉淀剂后发生。
实验材料：1. 硝酸银溶液。
2. 氯化钠溶液。
3. 硝酸铜溶液。
4. 碳酸钙溶液。
5. 硝酸钡溶液。
6. 硫酸铜溶液。
实验步骤：1. 取一小部分硝酸银溶液倒入试管中；2. 分别加入少量氯化钠溶液和硝酸铜溶液，观察产生的沉淀情况；3. 取一小部分碳酸钙溶液倒入试管中；4. 加入少量硝酸铜溶液，观察产生的沉淀情况；5. 取一小部分硝酸钡溶液倒入试管中；6. 加入少量硫酸铜溶液，观察产生的沉淀情况。
实验结果：1. 在硝酸银溶液中加入氯化钠溶液后产生了白色沉淀，反应方程式为AgNO3+ NaCl → AgCl↓ + NaNO3；2. 在硝酸银溶液中加入硝酸铜溶液后未观察到明显沉淀产生；3. 在碳酸钙溶液中加入硝酸铜溶液后未观察到明显沉淀产生；4. 在硝酸钡溶液中加入硫酸铜溶液后产生了白色沉淀，反应方程式为Ba(NO3)2 + CuSO4 → BaSO4↓ + Cu(NO3)2。
实验分析：通过本次实验，我们观察到了不同物质间的沉淀反应。
在硝酸银溶液中，氯化钠与硝酸银发生沉淀反应，生成了白色的氯化银沉淀。
而在硝酸银溶液中加入硝酸铜溶液后，并未观察到沉淀的产生。
这是因为硝酸银和硝酸铜在溶液中并没有发生置换反应，因此没有产生沉淀。
在碳酸钙溶液中加入硝酸铜溶液后也未观察到沉淀的产生，这是因为碳酸钙和硝酸铜在溶液中也没有发生置换反应。
最后，在硝酸钡溶液中加入硫酸铜溶液后产生了白色硫酸钡沉淀，这是因为硝酸钡和硫酸铜发生了置换反应，生成了不溶于水的硫酸钡沉淀。
实验总结：通过本次实验，我们对沉淀反应有了更深入的了解。
实验二蛋白质的沉淀反应
实验二蛋白质的沉淀反应一、蛋白质等电点的测定：1.目的：(1)了解蛋白质的两性解离性质。
(2)学习测定蛋白质等电点的一种方法2.原理：蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3.器材：(1)水浴锅。
(2)温度计。
(3)200毫升锥形瓶。
(4)100毫升容量瓶。
(5)吸管。
(6)试管。
(7)试管架。
(8)乳钵。
4.试剂：(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200毫升取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
(2)1.00当量／升醋酸溶液100毫升(3)0.10当量／升醋酸溶液100毫升(4)0.01当量／升醋酸溶液50毫升5.操作方法：(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。
此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
蛋白质的沉淀反应剖析
3．有机酸沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察 沉淀的生成。
4．有机溶剂沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
5、乙醇引起的变性与沉淀： 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：
试剂（mL）
试管编号
1
2
3
蛋白质溶液
1.0
1.0
1.0
pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液
1.0
—
—
0.1mol/L氢氧化钠溶液
—
1.0
—
0.1mol/L 盐酸溶液
—
—
1.0
95%乙醇
2.0
2.0
2.0
摇匀后，观察是否有沉淀生成。放置片 刻，向各管内加水4mL，然后在2，3号管中 各加1滴甲基红，观察颜色的变化。 接着2 号管用0.1mol/L醋酸溶液中和， 3号管用 0.05mol/L碳酸钠溶液中和，观察颜色的变 化和沉淀的生成。最后各管再加0.1mol/L盐 酸溶液数十滴，观察沉淀的再溶解。
观察沉淀是否溶解，为什么？ 向另一离心管的上清液添加硫酸铵粉末，边
加边搅，直至硫酸铵粉末不再溶解达到饱和为 止，此时析出的沉淀为清蛋白。静置5min 后， 离心（3000r/min） 10min，倒去上清液，向 沉淀中加少量水，观察沉淀是否溶解。
2．重金属盐沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入 2滴3%硝酸银溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应 指蛋白质分子的结
构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素 后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。例如大多数蛋 白质的盐析作用或在低温下用乙醇（丙酮） 短时间作用于蛋白质等。提纯蛋白质时，常 用此类反应。
《兽医免疫学》实验课件：实验二 沉淀反应
B
B
A
A抗体中针对B抗原 的抗体可以 跨越透过C抗原来自BCA
二、双向琼脂扩散试验
实验材料：
1、鸡传染性法氏囊病毒标准抗原； 2、鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清； 3、待检血清：来自受检鸡的新鲜血清； 4、平皿（Φ6cm）、打孔器、微量加样器等；
二、双向琼脂扩散试验
5、琼脂凝胶板： 将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装
入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿 内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝 固后按如下图方式打孔。 注意:孔间距为孔的直径大小,打孔完毕要封底）
二、双向琼脂扩散试验
实验步骤：
中间孔加标准抗原， 外周孔加被检血清及阳性 血清（如要测被检血清的 效价，外周孔可倍比稀释 后依次加入）。加样后盖 上皿盖，37℃扩散24小时， 观察结果。
实验二 沉淀反应
一、环状沉淀反应 二、双向琼脂扩散试验
一、环状沉淀反应
目的：以炭疽环状沉淀反应为例，掌握 沉淀反应原理、操作方法及结果 的判定方法。
原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如 果二者相应，则可在抗原、抗体两 液接触界面形成白色的沉淀环。
一、环状沉淀反应
实验材料：
1．被检抗原（沉淀原）的制备： （1）热浸法 取可疑材料约1克，研碎，加入510mL生理盐水混合，转至试管内，煮沸30min，取出 冷却，用滤纸过滤，滤液即为被检的沉淀原。 （2）冷浸法 取疑为炭疽的皮革和兽毛，高压灭 菌后，取1cm2或兽毛数克浸于5-10倍的0.5%石炭酸生 理盐水中，4℃浸渍18-24小时，同上法过滤。
原理：
可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼 脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相 遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处 形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于 组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而对其它 的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种 AgAb系统的沉淀物。
实验二凝集沉淀反应
材料：
待测血清、 AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）、 生理盐水、琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、酒精灯。
.
15
双向扩散法测血清中AFP操作步骤
1、制备琼脂板：
1%盐水琼脂加热溶化，取5ml均匀铺与载玻片上。
2、打孔：
琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，针头取出孔中琼脂。
3、封底：
用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。
应用:
检测 AFP 、HBsAg, 协助疾病诊断.
.
14
双向琼脂扩散法测血清中AFP
甲胎蛋白（AFP）：
是一种在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成的α球蛋白， 存在于胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常 成人血清中仅含极微量的AFP，经典的免疫学方法检测 不出。
当肝细胞发生癌变时，AFP含量增高，测血清中AFP， 可协助诊断原发性肝癌。
本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度 约为10～20μg／ml.
应用:
人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。
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12
单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
.
13
（二）双向琼脂扩散试验 （操作）
原理:
将可溶性抗原与相应抗体两种溶液置于琼脂糖凝胶的不 同位置，使两者在凝胶中各自向四周扩散,抗原与抗体相遇并 在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。
伤寒血清 ＋
待测菌液
阴性
.
？
8
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
沉淀反应
免疫学试验计划实验二沉淀试验——双向免疫扩散试验一、目的要求：1、掌握双向免疫扩散试验的原理和用途；2、熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。
二、实验原理：1、沉淀反应：可溶性抗原（如血清、细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相应的抗体相遇，当二者比例适当，在一定温度、pH并有电解质存在下，就可能形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应。
根据抗原与抗体的不同反应与其它因素，沉淀反应分为：凝胶内沉淀反应（单向琼脂扩散、双向琼脂扩散等）、免疫电泳技术（对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫琼脂扩散电泳等）、液相内沉淀反应（环状沉淀反应、免疫浊度试验、絮状沉淀反应等）。
单向沉淀、双向沉淀。
2、抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应. 它既可发生在体内，也可发生在体外。
体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。
沉淀反应（precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。
如图所示：3、影响沉淀反应的主要因素：（1）.抗原（Ag）、抗体（Ab）反应的浓度、比例（2）.电解质（3）.温度（4）.酸碱度4、双向免疫扩散试验：将可溶性抗原和抗体分别加到含适量电解质的琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周自由扩散，若抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例合适处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。
沉淀物形成的主要原因是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分。
利用琼脂凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂凝胶，其内部为多孔网状。
而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。
因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂凝胶中几乎可以自由扩散。
而且琼脂凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
沉淀反应实验报告
沉淀反应实验报告沉淀反应实验报告引言：沉淀反应是化学实验中常见的一种反应类型，通过溶液中的离子相互作用形成固态沉淀物。
本次实验旨在通过观察和分析沉淀反应的过程和结果，探究反应条件对沉淀形成的影响。
实验目的：1. 理解沉淀反应的基本原理和过程；2. 掌握沉淀反应的实验操作技巧；3. 研究不同条件下沉淀反应的变化规律。
实验材料和仪器：1. 实验材料：氯化银(AgCl)、氯化钡(BaCl2)、硝酸银(AgNO3)、硫酸钡(BaSO4)、盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、蒸馏水；2. 实验仪器：试管、滴管、玻璃棒、烧杯、热水浴。
实验步骤：1. 实验前准备：清洗实验仪器，准备所需试剂；2. 实验一：向两个试管中分别加入等量的氯化银溶液和硝酸银溶液，观察并记录反应结果；3. 实验二：向两个试管中分别加入等量的氯化钡溶液和硫酸钡溶液，观察并记录反应结果；4. 实验三：在一试管中加入氯化银溶液，滴加盐酸，观察并记录反应结果；5. 实验四：在一试管中加入氯化银溶液，滴加硝酸，观察并记录反应结果；6. 实验五：在一试管中加入氯化银溶液，加热至沸腾，观察并记录反应结果。
实验结果和分析：1. 实验一中，氯化银溶液与硝酸银溶液反应后生成白色沉淀，即氯化银(AgCl)。
这是因为氯化银溶液中的氯离子与硝酸银溶液中的银离子发生反应，生成不溶于水的氯化银沉淀。
2. 实验二中，氯化钡溶液与硫酸钡溶液反应后生成白色沉淀，即硫酸钡(BaSO4)。
这是因为氯化钡溶液中的钡离子与硫酸钡溶液中的硫酸根离子发生反应，生成不溶于水的硫酸钡沉淀。
3. 实验三中，氯化银溶液与盐酸反应后生成白色沉淀，即氯化银(AgCl)。
这是因为盐酸中的氯离子与氯化银溶液中的银离子发生反应，生成不溶于水的氯化银沉淀。
此外，盐酸的加入使反应溶液的酸碱度增加，促进了沉淀反应的进行。
4. 实验四中，氯化银溶液与硝酸反应后生成白色沉淀，即氯化银(AgCl)。
这是因为硝酸中的硝酸根离子与氯化银溶液中的银离子发生反应，生成不溶于水的氯化银沉淀。
实验二沉淀反应
沉淀反应
一、实验内容
1.双向琼脂扩散试验(小组做)
2.单向琼脂扩散试验(示教) 3.免疫电泳(示教) 4.火箭电泳(示教) 5.尿液HCG检测(胶体金免疫法 ) (小组操作) 6.录像：免疫反击战
免疫标记技术
沉淀反应
二、目的与要求
1.掌握单扩、双扩基本原理、方法、结果
分析及应用。
2.熟悉免疫电泳基本原理及应用。
用途：抗原或抗体的检测，定性或可粗略定量。
缺点：需时长，灵敏度不高。
3.单向琼脂扩散试验（示教）
Ag稀释度
1 :80 1 :40
1 :20
1 :10
用途：已知抗体测抗原，定量实验； 缺点：耗时长。
4.免疫电泳（示教）
1
2
先Ag电泳，后扩散。
注意：1、2孔为Ag样本孔。
免疫电泳的用途：
A.用于某种蛋白缺乏的疾病的诊断；
B.用于抗原纯度的定性分析。
5.火箭电泳（示教）
火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电场 用途：已知抗体测抗原，定量实验；
优点：耗时短，反应敏感性好。
四、操作内容
1.甲胎蛋白(AFP)的检测（小组操作）
（1）材料：
A.待测Ag： AFP可疑血清； B.阳性对照：AFP阳性血清； C.阴性对照：生理盐水（NS）
早早孕HCG胶体金试纸,采用了双抗体夹心 法的检测模式。
HCG金标试纸
带条中含有均匀分布的胶 体金标记的鼠抗人HCG单抗 1.鼠抗人HCG单抗 (固定的检测线) 2.羊抗鼠IgG(固定的质控线)
标志线
尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG结合形成免疫复合物； 随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色
在检测线未结合的金标记鼠抗人 HCG 单抗 (IgG) 随着尿液上行 , 到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。
沉淀实验的实验报告
一、实验目的1. 理解沉淀反应的基本原理，掌握沉淀反应的实验操作方法。
2. 学习利用沉淀反应进行物质的分离、提纯和鉴定。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理沉淀反应是指溶液中离子或分子结合成难溶物质的过程。
在实验中，通过添加适当的沉淀剂，使溶液中的目标物质生成沉淀，从而实现分离、提纯和鉴定。
沉淀反应的原理主要基于溶解度积（Ksp）的概念。
溶解度积是指在一定温度下，难溶电解质在溶液中达到饱和时，其离子浓度的乘积。
当溶液中离子的浓度乘积大于溶解度积时，难溶电解质将开始沉淀；当溶液中离子的浓度乘积小于溶解度积时，沉淀将溶解。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 氯化钠溶液- 硫酸铜溶液- 氢氧化钠溶液- 硫酸铝溶液- 硫酸铁溶液- 硝酸银溶液- 硝酸铅溶液- 氯化银溶液- 氢氧化铁溶液- 硫酸钡溶液- 硫酸钙溶液- 氯化钙溶液2. 实验仪器：- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 滴定管- 滤纸- 铁架台- 漏斗- 研钵- 研杵四、实验步骤1. 沉淀反应实验一：硫酸铜与氢氧化钠反应- 在烧杯中加入5mL氯化钠溶液，滴加少量硫酸铜溶液，观察溶液颜色变化。
- 滴加氢氧化钠溶液，观察沉淀的形成。
- 用滤纸过滤沉淀，观察沉淀的颜色和形态。
2. 沉淀反应实验二：硫酸铝与硫酸铁反应- 在烧杯中加入5mL硫酸铝溶液，滴加少量硫酸铁溶液，观察溶液颜色变化。
- 滴加氢氧化钠溶液，观察沉淀的形成。
- 用滤纸过滤沉淀，观察沉淀的颜色和形态。
3. 沉淀反应实验三：硝酸银与氯化钠反应- 在烧杯中加入5mL硝酸银溶液，滴加少量氯化钠溶液，观察溶液颜色变化。
- 滴加硝酸铅溶液，观察沉淀的形成。
- 用滤纸过滤沉淀，观察沉淀的颜色和形态。
4. 沉淀反应实验四：硫酸钡与硫酸钙反应- 在烧杯中加入5mL硫酸钡溶液，滴加少量硫酸钙溶液，观察溶液颜色变化。
- 滴加氯化钙溶液，观察沉淀的形成。
- 用滤纸过滤沉淀，观察沉淀的颜色和形态。
沉淀反应实验报告
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。
不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。
另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。
如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、ph试纸6、水浴锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。
此试剂可长期保存。
4、尿素晶体5、1%cuso：1g cuso晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 446、10%naoh：10g naoh溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤蛋白质的颜色反应（一）米伦（millon’s）反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。
实验二蛋白质的沉淀作用及可逆
10% NaOH 溶液
蒸馏 水 7 2 2
－ 5
1 2 3
4 5
10 10 10
10 10
－ 5 －
－ －
－ － 5
5 －
－ － －
2 －
－ － －
－ 2
加毕，将各管混匀，观察、记录各管现象后，然后放入 100℃恒温水浴中保温（或沸水浴中）10 min，注意观 察、比较管的沉淀情况。然后，将第3，4，5号管分别 用10％NaOH溶液或10％乙酸溶液中和，观察并解释实 验结果。
2、实验器材
(1)试管; (2) 试管架; (3)小玻璃漏斗; (4)滤纸; (5)玻棒 (6)烧杯; (7)量筒; (8)恒温水浴箱
四、操作方法
1、蛋白质的盐析 加蛋白质氯化钠溶液3 ml于试管中，再加等量的饱 和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟则析出球蛋白的沉淀。 倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解。将管中 内容物过滤，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边 用玻璃棒搅拌．直至粉末不再溶解为止，此时析出的沉 淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉 淀的再溶解。 2、重金属离子沉淀蛋白质 取2支试管，各加入蛋白质溶液1 ml，再分别加 5%硝酸银溶液和1％硫酸铜溶液1-2滴，振荡试管，有 沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量 的水，观察沉淀是否溶解？
思 考 题
剂 i ]
1、沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往伴 随变性？ 2、鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解毒剂？ 3、氯化汞为何能做为杀菌剂？
5、生物碱试剂沉淀蛋白质
取试管2支，各加入1 ml蛋白质溶液及1％乙酸溶液2—3滴。 向一管中加入5%鞣酸溶液数滴，另一管加入饱和苦味酸溶液数滴， 观察结果。
实验二 沉淀试验
鸡传染性法式囊病毒琼脂免疫扩散试验；
三、实验步骤
吸取3-5ml加热融化（含有8％氯化钠） 琼脂平板的配制 1％的琼脂，浇注在干净载玻片上，待 凝固后使用。 用直径为4mm左右的打孔器在琼脂上打出个 打孔 梅花孔，中间孔与周围孔距离为3mm左右， 挑取孔中琼板背面放到火焰上轻轻灼烧，用手背 感觉微烫即可！ 在中央孔加入抗原，周围孔分别加入标准阴 阳性血清，以及被检血清。 加毕后，将琼脂板平放入铺有数层湿纱布的 带盖搪瓷盘内，置37℃条件下孵育，作用24 －48小时，观察结果。
实验七 沉淀试验
一 实验原理： 可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料 浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多 糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后， 在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色 絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称 为沉淀反应。 沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮 状沉淀反应和琼脂扩散反应。
二实验内容：
结果判定： 抗原孔与标准阳性血清之间出现白色沉淀 线，与阴性血清无沉淀线。 抗原与检测血清间出现沉淀线为阳性， 否则为阴性
实验分析讨论：
1、记录实验结果，分析产生结果的原因。 2、请思考在琼脂扩散试验中哪些因素会对结 果产生影响。
实验二、沉淀反应
实验二沉淀反应一、实验目的1、了解沉淀的生成、溶解和沉淀的转化条件，掌握沉淀平衡，同离子效应以及溶度积原理。
2、学习离子分离操作和同离子效应和电动离心机的使用。
二、实验的内容1、沉淀的生成和溶解①查表得：PbI2的ksp为7.1×10-9取1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2+9d水，取1d+9d水，配成1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液取1d 0.1mol/L的kI+9d水，取其中1d+9d水，再取1d+1d 水+首先配好的1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液2d→不出现黄色沉淀，溶液无变化。
计算：Q=【pb2+】·【I-】2=25/8×10-11﹤ksp计算值也不应该有沉淀。
反应方程：pb2++ 2I-≒pbI2实验结论：1、计算结果与实际相符，Q﹤ksp，不出现沉淀2、没看到pbI2黄色沉淀，不等于不存在pbI2，溶液中还是存在少量的pbI2②查表得：pbs的ksp=8×10-28 pbcro4ksp=2.8×10-13取1d 0.1mol/L的Na2S+1d0.1mol/L的k2cro4,稀释至2.5mL 取1d上述溶液+1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2→有棕黄色的混合沉淀出现。
计算：Q﹙pbs﹚=【S2-】【pb2+】=4×10-6﹥其kspQ﹙pbcro4﹚=【S2-】【cro42-】=4×10-6﹥其ksp反应方程：pb2++ S2-≒pbs pb2++ cro42-≒pbcro4实验结论：只要Q﹥ksp，就会出现沉淀，在同一溶液中也不会因沉淀的ksp的大小而出现沉淀的先后，而是同时沉淀。
如随着某离子的加入，Q先达到某个沉淀的ksp，后达到另一个沉淀的ksp，这是才会出现沉淀的先后之分。
2、沉淀的溶解和转化1d 0.1mol/L Pb（NO3）2+2d 0.1mol/L NaCL→Pbcl2↓（白色）+2d 0.1mol/L kI溶液→pbI2↓(黄色) {离心，去掉上清液→稀释至0.5mL}+饱和Na2so4晶体→ pbso4↓(白色) +0.1mol/L k2cro4→pbcro4↓（黄色）+2~3d 0.1mol/L k2S→pbs↓(黑色) {离心，取上清液，颜色为粉红色}★查表得：ksp（Pbcl2）=1.6×10-5 ksp（pbI2）=7.1×10-9 ksp（pbso4）=1.6×10-8ksp（pbcro4）=2.8×10-13 ksp（pbs）=8×10-28★计算：例Pbcl2转化为pbI2的过程：Pbcl2+ 2I-≒pbI2+2cl-K°=【cl-】2/【I-】2=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【I-】2= ksp （Pbcl2）/ ksp（pbI2）=1.6/7.1×104K°值越大，沉淀转化的越完全，对同一类型的沉淀来说，溶度积越大的沉淀越易转化成溶度积小的沉淀对ksp小→ksp大的方向进行的特例：ksp（pbI2）/ ksp（pbso4）=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【so42-】推出→【so42-】min=0.16/7.1 因此Na2so4晶体或饱和Na2so4溶液满足此条件。
实验三 蛋白质的性质实验(二)-沉淀反应
2．重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质 结合成不溶于水的复合物。 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸 银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片 刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀 是否溶解？为什么？ 3．某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋 白质溶液2 ml，再加1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡 试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液， 向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 4．有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2 ml蛋 白质溶液，再加入2 ml 95%乙醇。混匀，观察沉 淀的生成。
五.操作方法
取4支同样规格的试管，按下表顺序加入各试 剂，然后混匀，静置10分钟，观察现象。
试 管 号 蒸馏 水 (ml) 0.01mo 0.1mol/ 1.0mol 酪蛋白 产生 l/L醋酸 L醋酸 /L醋酸 醋酸钠 混浊 (ml) (ml) (ml) 溶液(ml) 否?
1 2 3 4
8.4 8.7 8.0 7.4
三、器材
1.水浴锅 2.温度计 3.200毫升锥型瓶 4.100毫升容量瓶 5.吸管 6.试管 7.试管架 8.乳钵
四.试剂: 1. 2. 3. 4. 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 1.00mol/L醋酸溶液 0.10mol/L醋酸溶液 0.01mol/L醋酸溶液 200毫升 100毫升 100毫升 50毫升
蛋白质等电点：当蛋白质颗粒上,正负电荷 数目相等时溶液的pH值。 处于等电点时的蛋白质在电场中不发生移 动；处于等电点时的蛋白质溶解度最低。 本实验测定蛋白质最低溶解度时的pH确定 蛋白质的等电点。
二、原理
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪
蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓 冲液。向缓冲液溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋 白的等电点。
实验三蛋白质的性质实验(二)-沉淀反应
硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。
有机溶剂沉淀蛋白质
有机溶剂沉淀法
在蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂，使蛋白 质沉淀析出的方法。
有机溶剂的作用
降低水的介电常数，消除或减少电荷间的相互作 用，使蛋白质失去水化层而聚集沉淀。
常用有机溶剂
乙醇、丙酮、甲醇等。
重金属盐沉淀蛋白质
01
02
03
重金属盐沉淀法
淀。
操作步骤
在蛋白质溶液中加入适量的盐溶 液（如硫酸铵、氯化钠等），搅 拌均匀后静置，待蛋白质沉淀后
将上清液与沉淀分开。
结果分析
通过离心或过滤的方法收集沉淀， 测定沉淀的质量和蛋白质含量，
计算沉淀收率。
有机溶剂沉淀蛋白质
原理
有机溶剂能够降低水的介电常数， 使蛋白质分子间的静电荷作用减 弱，导致蛋白质凝聚成沉淀。
实验结果
在实验中，我们观察到加入有机溶剂后，蛋白质溶液逐渐浑浊，最 终形成白色沉淀。
结果分析
有机溶剂沉淀实验结果表明，有机溶剂能够有效降低蛋白质的溶解 度，促使其从溶液中沉淀出来。
重金属盐沉淀蛋白质结果分析
1 2
实验原理
重金属盐能够与蛋白质结合形成不溶于水的复合 物，从而降低蛋白质的溶解度，使其沉淀。
实验的应用与拓展
应用
本实验方法可用于初步分离和纯 化蛋白质，为后续蛋白质的结构 和功能研究提供基础。
拓展
本实验方法还可以应用于生物制 品、食品、药品等领域中的蛋白 质分离纯化，为相关产品的研发 和质量控制提供技术支持。
感谢您的观看
THANKS
操作步骤
在蛋白质溶液中加入适量的有机溶 剂（如甲醇、乙醇等），搅拌均匀 后静置，待蛋白质沉淀后将上清液 与沉淀分开。
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一、环状沉淀反应
2．炭疽标准抗原 3、炭疽阴性抗原（健康组织浸出液） 4．阳性、阴性炭疽沉淀素血清
5．毛细吸管
沉淀反应管（Φ 0.3-0.4cm ）
一、环状沉淀反应
实 验 步 骤
设 阳 性 、 阴 性 静 用另一支毛细吸管吸取被检 对 置 材料，插入离沉淀管底近1/3 照 5 处，沿管壁缓慢加入到沉淀 － 10 素的上面，边注边提使达到 2/3高度处即可。 min 用毛细吸管吸取炭疽沉淀 素，插入沉淀反应管底部， 缓慢注入到距管底的1/3 处。
沉淀线，并对其进行简要说明。
ห้องสมุดไป่ตู้
阳性对照沉淀线融合。
阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。
带现象（zone
phenomenon）
一种抗原-抗体反应的现象。在凝集反应或沉淀 反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗 体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉 眼可见的反应现象。 抗体过剩：前带现象；
抗原过剩：后带现象。
作业：
完成实验报告，画出你所观察到的
结 果 观 察
一、环状沉淀反应
试验组
阳性对照组
阴性对照组
一、环状沉淀反应
结果判定：
两液面交界处出现清晰、致密
如线的白轮，是炭疽阳性。
无此现象为炭疽阴性。
二、双向琼脂扩散试验
目的：掌握双向琼脂扩散试验的原理、
操作方法及结果判定方法。
二、双向琼脂扩散试验
原理：
可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼 脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散 相遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相 遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀 带对于组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而 对其它的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代 表一种AgAb系统的沉淀物。
二、双向琼脂扩散试验
实验材料：
1、鸡传染性法氏囊病毒标准抗原；
2、鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清；
3、待检血清：来自受检鸡的新鲜血清；
4、平皿（Φ6cm）、打孔器、微量加样器等；
二、双向琼脂扩散试验
5、琼脂凝胶板： 将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装 入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿 内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝固 后按如下图方式打孔。
注意:孔间距为孔的直径大小,打孔完毕要封底）
二、双向琼脂扩散试验
实验步骤：
中间孔加标准抗原， 外周孔加被检血清及阳性 血清（如要测被检血清的 效价，外周孔可倍比稀释 后依次加入）。加样后盖 上皿盖，37℃扩散24小时， 观察结果。
Ag
生理 盐水
? Ab
二、双向琼脂扩散试验
结果判断：
阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时， 受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与
实验二 沉淀反应
一、环状沉淀反应 二、双向琼脂扩散试验
一、环状沉淀反应
目的：以炭疽环状沉淀反应为例，掌握 沉淀反应原理、操作方法及结果 的判定方法。
原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如
果二者相应，则可在抗原、抗体两 液接触界面形成白色的沉淀环。
一、环状沉淀反应
实验材料：
1．被检抗原（沉淀原）的制备： （1）热浸法 取可疑材料约1克，研碎，加入510mL生理盐水混合，转至试管内，煮沸30min，取出 冷却，用滤纸过滤，滤液即为被检的沉淀原。 （2）冷浸法 取疑为炭疽的皮革和兽毛，高压灭 菌后，取1cm2或兽毛数克浸于5-10倍的0.5%石炭酸生 理盐水中，4℃浸渍18-24小时，同上法过滤。