实验八.SDS-PAGE测定蛋白质分子量
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光吸收 检测 考玛斯亮篮染色
染色
银 染 色
二、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE） 测定蛋白质的分子量
SDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基 的分子量。与其它方法相比，它不需 要昂贵的仪器设备，操作简便，能在 较短的时间内得到结果，有较高的重 复性。且不需要非常纯的样品，因此 是目前用于测定蛋白质亚基的分子量 的一种最好的方法。
垂直柱状，板状的 不连续凝胶电泳系 统的组成和配制
缓冲液系统
• 浓缩凝胶缓冲液
0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 • 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 • 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴 酚蓝 • 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、 生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。
实验原理
• 1)
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 二硫键是否完全被还原
光照
还原型
O2
游离基
聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应
• 凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩
散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 响．
• 大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影 • 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力
ab b 100(％ C 100 （％） T ） a＋b m
• 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，
m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富
有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
聚丙烯酰胺的聚合及影响因素
① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺 （TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连 锁反应形成网状的聚合物。 • 丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自 由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚 合速率减慢。 • 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在 25 ℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。 • 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP） 分解。故在做胶后常要用水进行封闭； • 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。
②光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下, 分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还 原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合 反应发生。 • 用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象； 故常用于样品胶的聚合； • 聚合的时间可以自由控制 • 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好； • 光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合 各种凝胶的聚合。 核黄素B1
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理 • 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离 外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高 电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差 别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性 质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量 大小相近，但构型不同时亦可分离。 碱性不连续－分离酸性样品 • 不连续凝胶电泳洗脱 酸性不连续－分离碱性样品
②分子筛效应
• 移动界面到达浓缩胶和分
离胶界面时，凝胶的PH变 化明显，缓冲液中甘氨酸 的觧离迅速增加，直至完 全觧离出 gly-,其分子量 小，迁移超过蛋白质分子。 而丧失夹击的作用；同时， 凝胶的孔径变小，降低了 蛋白质的迁移率。故蛋白 质分子在均一的电压梯度 和PH 值中泳动，依其分 子量的大小而分开。
2)
3)
实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全
打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋 wk.baidu.com质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰 凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成 亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常 或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。
③电荷效应
蛋白质所带的净电的性 质和电荷量与分子的迁 移率的关系，在同一电 场强度中，在单位时间 内各分子迁移的距离的 差别而到达分离。
操作
PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3
1. 垂直柱状，板状的不 2. 3. 4. 5. 6. 7.
连续凝胶电泳系统的 组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶 配制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 测定蛋白质分子量
实验目的
• 学习PAGE分离蛋白质的原理 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 及染色鉴定。
一. PAGE分离蛋白质的原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
实验原理
引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳--PAGE
T=
a+b
m C=
X100% b x100
a+b
C=6.5-0.3T 稀溶液
浓溶液－ －交联剂
聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构
凝胶－ －结点
T
ab m
100(％
C
b ab
1001 ％
凝胶浓度的计算
• 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
• T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度相关的交联百分
浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的 浓度。
迁 移 率
A B 5 7 9 11 13 15 T%
凝胶浓度T对样品迁移率的影响 例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T ＝5％时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T＝ 9 ％时， A，B的迁移率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小， A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获 得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
标准蛋白质样品
• 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）
已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。 样品的浓度 • 分析目的、检测方法和样品的组成 是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml 加样 电泳
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基硫酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取 Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.9， 最 后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品溶解缓冲液：称取 Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
•
•
•
实验试剂和器材
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行 电泳分离。
①.浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径
（稀） T＜5％，分离胶一般为小 孔径（浓）T﹥7.5％。样品在较稀 的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时， 便形成一道栅栏，所有的样品分子 在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得 到浓缩，然后，再依据分子量的大 小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的 不连续，各种分子的电荷之间的差 异进行分离。 3.缓冲体系的不连续，其中各组成 的离子、快慢离子迁移快慢的差别 是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续 又造成电场强度与电导率的变化。
（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应 （Molecular sieving effect）.
• 有效孔径取决于凝胶的总浓度 T％，孔径随着 T% 的增加而减小。
甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，有效孔径最小；T= 5%时，甲基双丙 稀酰胺的浓度为5%时，孔径为20nm。
(Polyacryamide gel electrophoresis)
• 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 • 由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大
分子混合物，而且可以研究生物大分子的 特性；如电荷、分子量、等电点及分子构 型。
聚丙烯酰胺凝胶的合成
丙稀酰胺 聚丙烯酰胺凝胶
催化剂 聚合反应
配制凝胶浓度计 算及经验公式
染色
银 染 色
二、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE） 测定蛋白质的分子量
SDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基 的分子量。与其它方法相比，它不需 要昂贵的仪器设备，操作简便，能在 较短的时间内得到结果，有较高的重 复性。且不需要非常纯的样品，因此 是目前用于测定蛋白质亚基的分子量 的一种最好的方法。
垂直柱状，板状的 不连续凝胶电泳系 统的组成和配制
缓冲液系统
• 浓缩凝胶缓冲液
0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 • 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 • 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴 酚蓝 • 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、 生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。
实验原理
• 1)
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 二硫键是否完全被还原
光照
还原型
O2
游离基
聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应
• 凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩
散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 响．
• 大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影 • 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力
ab b 100(％ C 100 （％） T ） a＋b m
• 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，
m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富
有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
聚丙烯酰胺的聚合及影响因素
① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺 （TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连 锁反应形成网状的聚合物。 • 丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自 由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚 合速率减慢。 • 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在 25 ℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。 • 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP） 分解。故在做胶后常要用水进行封闭； • 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。
②光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下, 分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还 原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合 反应发生。 • 用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象； 故常用于样品胶的聚合； • 聚合的时间可以自由控制 • 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好； • 光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合 各种凝胶的聚合。 核黄素B1
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理 • 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离 外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高 电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差 别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性 质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量 大小相近，但构型不同时亦可分离。 碱性不连续－分离酸性样品 • 不连续凝胶电泳洗脱 酸性不连续－分离碱性样品
②分子筛效应
• 移动界面到达浓缩胶和分
离胶界面时，凝胶的PH变 化明显，缓冲液中甘氨酸 的觧离迅速增加，直至完 全觧离出 gly-,其分子量 小，迁移超过蛋白质分子。 而丧失夹击的作用；同时， 凝胶的孔径变小，降低了 蛋白质的迁移率。故蛋白 质分子在均一的电压梯度 和PH 值中泳动，依其分 子量的大小而分开。
2)
3)
实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全
打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋 wk.baidu.com质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰 凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成 亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常 或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。
③电荷效应
蛋白质所带的净电的性 质和电荷量与分子的迁 移率的关系，在同一电 场强度中，在单位时间 内各分子迁移的距离的 差别而到达分离。
操作
PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3
1. 垂直柱状，板状的不 2. 3. 4. 5. 6. 7.
连续凝胶电泳系统的 组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶 配制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 测定蛋白质分子量
实验目的
• 学习PAGE分离蛋白质的原理 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 及染色鉴定。
一. PAGE分离蛋白质的原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
实验原理
引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳--PAGE
T=
a+b
m C=
X100% b x100
a+b
C=6.5-0.3T 稀溶液
浓溶液－ －交联剂
聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构
凝胶－ －结点
T
ab m
100(％
C
b ab
1001 ％
凝胶浓度的计算
• 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
• T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度相关的交联百分
浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的 浓度。
迁 移 率
A B 5 7 9 11 13 15 T%
凝胶浓度T对样品迁移率的影响 例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T ＝5％时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T＝ 9 ％时， A，B的迁移率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小， A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获 得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
标准蛋白质样品
• 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）
已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。 样品的浓度 • 分析目的、检测方法和样品的组成 是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml 加样 电泳
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基硫酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取 Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.9， 最 后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品溶解缓冲液：称取 Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
•
•
•
实验试剂和器材
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行 电泳分离。
①.浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径
（稀） T＜5％，分离胶一般为小 孔径（浓）T﹥7.5％。样品在较稀 的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时， 便形成一道栅栏，所有的样品分子 在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得 到浓缩，然后，再依据分子量的大 小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的 不连续，各种分子的电荷之间的差 异进行分离。 3.缓冲体系的不连续，其中各组成 的离子、快慢离子迁移快慢的差别 是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续 又造成电场强度与电导率的变化。
（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应 （Molecular sieving effect）.
• 有效孔径取决于凝胶的总浓度 T％，孔径随着 T% 的增加而减小。
甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，有效孔径最小；T= 5%时，甲基双丙 稀酰胺的浓度为5%时，孔径为20nm。
(Polyacryamide gel electrophoresis)
• 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 • 由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大
分子混合物，而且可以研究生物大分子的 特性；如电荷、分子量、等电点及分子构 型。
聚丙烯酰胺凝胶的合成
丙稀酰胺 聚丙烯酰胺凝胶
催化剂 聚合反应
配制凝胶浓度计 算及经验公式