实验八.SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。
1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。
本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。
二、仪器与试剂1、材料：硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。
2、试剂：（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）（2）10%的SDS溶液（3）10%的过硫酸铵溶液（4）四甲基乙二胺（TEMED）（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8（7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3（8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰（9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液（10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液（11）标准分子量蛋白。
3、仪器设备：电泳仪、垂直电泳槽等。
三、操作步骤1、凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。
将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量一、药剂准备a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml3、10%SDS 5ml4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。
可可5、TEMED 0.5 ml6、1M Tris-HCL,PH6.8 15mlb、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）2ml，1ml/管，共2管c、蛋白质分子量标准（200ul）d、SDS-PAGE电泳液（1L）由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。
（不宜超过两周）e、考马斯亮染色液（250ml）f、考马斯亮染色脱色液（500ml）注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：甲醇或者乙醇乙酸250ml 80ml去离子水补至 1000ml,混匀，备用。
二、器材准备移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子三、SDS-PAGE 分析操作过程：1、配制蛋白质溶液用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。
确保质量分数为3～5g/L。
试管依次标号1、2、3、4、5。
用保鲜膜和皮筋封口保存备用。
最好当天现配。
2、制分离胶（即下胶层）鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。
按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。
依照15%胶，5ml（打勾）一栏。
如图：注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。
a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。
b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。
蛋白质分子量测定实验报告
蛋白质分子量测定实验报告实验报告：蛋白质分子量测定一、实验目的1.掌握蛋白质分子量测定的基本原理和方法。
2.学习使用SDS-PAGE电泳技术测定蛋白质分子量。
3.了解蛋白质的基本性质和分子结构。
二、实验原理蛋白质分子量测定是蛋白质研究中的基本操作之一。
通过测定蛋白质的分子量，可以了解蛋白质的结构、功能和分类等信息。
常用的蛋白质分子量测定方法有SDS-PAGE电泳、渗透压法、凝胶色谱法等。
本实验采用SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE电泳法是一种基于电泳分离和分子筛作用的蛋白质分离技术。
在SDS-PAGE电泳中，样品蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，然后在电场作用下迁移。
由于SDS的分子量已知，因此根据迁移率和分子量的关系，可以通过计算得出蛋白质的分子量。
三、实验步骤1.准备试剂和仪器（1）试剂：蛋白质样品、SDS、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、甘氨酸碱溶液、冰醋酸、超纯水。
（2）仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、摇床、离心管、移液器、计时器、分光光度计。
2.样品制备（1）将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）稀释至一定浓度。
（2）加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，搅拌均匀。
（3）煮沸5-10分钟，使蛋白质变性并充分与SDS结合。
（4）离心10分钟，取上清液备用。
3.电泳分离（1）按照电泳仪使用说明书，装配垂直板电泳槽，加入预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。
（2）将制备好的样品加入电泳槽中，注意不要产生气泡。
（3）接通电泳电源，调节电压为100V，开始电泳分离。
（4）电泳过程中保持温度恒定，并及时补充水以保持电泳槽中的水平。
（5）当样品迁移至距底部约1cm时，停止电泳。
4.染色与脱色（1）将凝胶取出，用自来水冲洗干净。
（2）加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下染色30分钟。
（3）加入脱色液，室温下脱色至背景清晰。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品, 则蛋白质分子中的二硫键被还原, 1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态, 使蛋白质亚基带上大量的负电荷, 其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时, 它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离, 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr, 简便、快速, 只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果, 在Mr为15000~200000的范围内, 与用其他方法测得的Mr相比, 误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法, 已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明, 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后, 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷, 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
1.在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时, 应注意以下几个问题:如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象, 就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个: ⑴二硫键是否完全被还原: 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下, SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去, 并使之具有相同的构象。
生物化学实验-SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量
2、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁 移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： ㏒10Mr = －b·mR + K
（式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。 在条件一定时，b 和K均为常数。）
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数 作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进 行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子 量。
2）1mol/L，pH8.8Tris-HCl缓冲液 Tris 21g 溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.8蒸馏水定容1000ml。
3）1mol/L，pH6.8 Tris-HCl 缓冲液 Tris21g 溶于蒸馏水，用浓 HCl调至 pH6.8 定容1000ml。
4Байду номын сангаас10%（W/V）SDS 5）10%（W/V）过硫酸铵（现用现配） 6）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
实验试剂
（1）标准蛋白质（低分子量Marker）
蛋白质名称
分子量
兔磷酸化酶B
97400
牛血清白蛋白
66200
兔肌动蛋白
43000
牛碳酸肝酶
31000
胰蛋白酶抑制剂
20190
鸡蛋清溶菌酶
14400
待测蛋白质：牛血清白蛋白、人血清蛋白
（2）凝胶试剂
1）30%（W/V）丙烯酰胺 30g 丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，储 于4℃暗处，一个月内可使用。
（3）10×电极缓冲液（pH8.3） Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸馏水并定 容至1000ml。使用时10倍稀释。
（4）2 样品稀释液 SDS 500mg，巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg， 1mol/L，pH6.8Tris-HCl 2ml，用蒸馏水定容至10ml。 按每份0.5-1.0ml分装，-20℃贮存。以此液制备样品时， 样品若为固体，应稀释1倍使用；样品若为液体，则加入 于样品等体积的原液混合即可。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量一、实验目的：1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2、学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、实验原理：SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS 是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
三、仪器、原料和试剂1、仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
2、原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
3、试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g 及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE法测定蛋白质分子量实验
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的：1. 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2. 学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfatc）是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS一蛋白质复合物。
SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4:1, 由于这种高密度的结合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响；SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度、相同的荷质比。
据流体力学等方面的研究推测，SDS-蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴恒定，与蛋白质种类无关，棒长轴变化，与蛋白质分子量成正比。
SDS和蛋白质结合后所形成的SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳迁移率的影响。
根据上面的分析，SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移率仅取决于蛋白质分子量的大小，因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋白质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量。
12. 当蛋白质的分子量在15kb～200kb之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：log Mr = K ― b*mR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；m为相对迁移率。
在条件一R定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
sds-page测定蛋白质的相对分子量
03 SDS-PAGE测定蛋白质相 对分子量的原理
蛋白质的相对分子量与迁移率的关系
蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率 与其相对分子量成反比，即相对分子 量越大，迁移速度越慢。
在电场的作用下，SDS将蛋白质分子 包裹起来，消除了蛋白质分子间的电 荷差异，使相对分子量成为影响迁移 率的唯一因素。
电泳
加样
将准备好的样品用微量移液器加到加 样孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳，注意控制电流 和电压，确保电泳过程稳定。
染色和脱色
染色
电泳结束后，将凝胶取出，放入含有染色液的容器中，染色一定时间，以便观 察蛋白质条带。
脱色
染色完成后，将凝胶取出，放入含有脱色液的容器中，脱色一定时间，以便观 察清晰的蛋白质条带。
将SDS和β-巯基乙醇加入样品中，以促进蛋白 质变性并带上负电荷。
煮沸处理
通过煮沸处理使蛋白质变性，并使SDS充分结合到蛋白质上。
凝胶制备
01
制备分离胶
按照分离胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到玻璃板中 的凹槽内。
聚合凝胶
02
03
制备浓缩胶
加入适量水，使分离胶聚合凝固。
按照浓缩胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到分离胶上。
计算相对分子量时需考虑实验条件、电泳缓冲液、电压等因素的影响，以 确保结果的准确性。
04 SDS-PAGE实验注意事项
避免样品降解
确保样品储存于低温环境
01
在实验过程中，应将未使用的样品保存在低温环境中，以避免
蛋白质降解。
避免样品反复冻融
02
反复冻融会使蛋白质发生变性，影响实验结果，因此应尽量减
SDS-PAGE可用于测定各种相对分子 量范围的蛋白质，从低到高均可。
SDSPAGE测量蛋白质分子量解析
10%Ap
150µl
TEMED
500µl
浓缩胶(5% 5ml)
3.2ml
0.85ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.65ml
50µl
50µl
200µl
3.样品及MW标准参照物溶液的制备
样品溶液和上样缓冲液混匀，使用前在100℃水浴 1min，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘 氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加 蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
4.上样。 15μl/孔
5.电泳
上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪开关，开始时 将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调 至20-30mA。待指示剂染料靠迁移至下沿1～1.5cm 处停止电泳，需2～3h。
6.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，将凝胶放入0.05% 考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2、掌握垂直板电泳的操作方法。
3、运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
l二、实验原理1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2、PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
蛋白分子量测定实验报告
蛋白分子量测定实验报告蛋白分子量测定实验报告引言：蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，其分子量的准确测定对于生物学研究以及医学诊断具有重要意义。
本实验旨在通过几种常用的方法，如SDS-PAGE、Western blot以及质谱分析，来测定蛋白质的分子量。
实验方法：1. SDS-PAGE：SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法，通过SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行变性，使其呈线性结构，并在电场作用下按照分子量大小进行迁移。
本实验选取了不同分子量的蛋白标准品，与待测蛋白样品一同加载至凝胶中，经电泳分离后，用Coomassie蓝染色显色。
根据标准品的迁移距离和蛋白样品的迁移距离，可以大致估计待测蛋白的分子量。
2. Western blot：Western blot是一种高灵敏度的蛋白质检测方法，结合了SDS-PAGE和免疫印迹技术。
首先，将蛋白样品经SDS-PAGE分离，然后将其转移到聚丙烯酰胺膜上。
接下来，使用特异性抗体与目标蛋白结合，并用酶标记的二抗进行检测。
最后，通过显色或发光的方式观察目标蛋白的存在与否。
通过与标准品的比对，可以推测待测蛋白的分子量。
3. 质谱分析：质谱分析是一种准确测定蛋白质分子量的方法。
通过将蛋白样品经过电喷雾或激光解离，得到蛋白质的质谱图。
质谱图中的峰值对应着不同的蛋白离子，根据其质荷比可以推测出蛋白质的分子量。
实验结果：在本实验中，我们选取了几种常见的蛋白质作为标准品，包括乳清蛋白、细胞色素C和胰岛素。
通过SDS-PAGE的分离，我们观察到这些标准品在凝胶上呈现出不同的迁移距离。
与标准品相比，待测蛋白样品的迁移距离可以推测出其大致的分子量范围。
通过Western blot的检测，我们成功地检测到了待测蛋白的存在，并与标准品进行了比对。
根据标准品的分子量和待测蛋白的迁移距离，我们可以初步确定了待测蛋白的分子量。
此外，我们还进行了质谱分析，得到了待测蛋白的质谱图。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）测定蛋白质分子量，简便、快速且重复性好，是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE或质谱的蛋白质分子量测定服务。
SDS-PAGE
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种间断的电泳系统，通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel ，PAG）组合使用可以消除结构和电荷的影响，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
蛋白质分子量即蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和。
蛋白质分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能正确与否。
测定蛋白质分子量的方法有很多，SDS-PAGE是主要方法之一，也是实验室使用最普遍的一种。
在SDS-PAGE中，已知分子量的标准蛋白质和未知样品同时电泳。
染色后，根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数，可得到一条标准曲线，利用未知样品的相对迁移率可在标准曲线上求得其分子量。
另外，SDS-PAGE法可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此使
测定结果更为准确。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。
二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。
这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。
蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。
然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。
三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。
2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。
3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。
4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。
5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。
首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。
6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。
一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。
四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。
条带的颜色越深，表示其含量越多。
通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。
五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。
相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。
通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。
实验八.SDS-PAGE测定蛋白质分子量
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
• T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度相关的交联百分
浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的 浓度。
迁 移 率
A B 5 7 9 11 13 15 T%
凝胶浓度T对样品迁移率的影响 例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T ＝5％时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T＝ 9 ％时， A，B的迁移率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小， A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获 得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。
标准蛋白质样品
• 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）
已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。 样品的浓度 • 分析目的、检测方法和样品的组成 是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml 加样 电泳
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实验试剂和器材
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
标准蛋白质样品
• 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）
已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。 样品的浓度 • 分析目的、检测方法和样品的组成 是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml 加样 电泳
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基硫酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取 Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.9， 最 后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品溶解缓冲液：称取 Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
③电荷效应
蛋白质所带的净电的性 质和电荷量与分子的迁 移率的关系，在同一电 场强度中，在单位时间 内各分子迁移的距离的 差别而到达分离。
操作
PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3
1. 垂直柱状，板状的不 2. 3. 4. 5. 6. 7.
连续凝胶电泳系统的 组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶 配制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理 • 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离 外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高 电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差 别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性 质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量 大小相近，但构型不同时亦可分离。 碱性不连续－分离酸性样品 • 不连续凝胶电泳洗脱 酸性不连续－分离碱性样品
T=
a+b
m C=
X100% b x100
a+b
C=6.5-0.3T 稀溶液
浓溶液－ －交联剂
聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构
凝胶－ －结点
T
ab m
100(％
C
b ab
1001 ％
凝胶浓度的计算
• 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 测定蛋白质分子量
实验目的
• 学习PAGE分离蛋白质的原理 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 及染色鉴定。
一. PAGE分离蛋白质的原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行 电泳分离。
①.浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径
（稀） T＜5％，分离胶一般为小 孔径（浓）T﹥7.5％。样品在较稀 的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时， 便形成一道栅栏，所有的样品分子 在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得 到浓缩，然后，再依据分子量的大 小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的 不连续，各种分子的电荷之间的差 异进行分离。 3.缓冲ห้องสมุดไป่ตู้系的不连续，其中各组成 的离子、快慢离子迁移快慢的差别 是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续 又造成电场强度与电导率的变化。
实验原理
• 1)
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 二硫键是否完全被还原
垂直柱状，板状的 不连续凝胶电泳系 统的组成和配制
缓冲液系统
• 浓缩凝胶缓冲液
0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 • 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 • 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴 酚蓝 • 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、 生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。
光照
还原型
O2
游离基
聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应
• 凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩
散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 响．
• 大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影 • 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
实验原理
引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
ab b 100(％ C 100 （％） T ） a＋b m
• 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，
m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富
有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
聚丙烯酰胺的聚合及影响因素
① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺 （TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连 锁反应形成网状的聚合物。 • 丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自 由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚 合速率减慢。 • 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在 25 ℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。 • 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP） 分解。故在做胶后常要用水进行封闭； • 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。
光吸收 检测 考玛斯亮篮染色
染色
银 染 色
二、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE） 测定蛋白质的分子量
SDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基 的分子量。与其它方法相比，它不需 要昂贵的仪器设备，操作简便，能在 较短的时间内得到结果，有较高的重 复性。且不需要非常纯的样品，因此 是目前用于测定蛋白质亚基的分子量 的一种最好的方法。
②分子筛效应
• 移动界面到达浓缩胶和分
离胶界面时，凝胶的PH变 化明显，缓冲液中甘氨酸 的觧离迅速增加，直至完 全觧离出 gly-,其分子量 小，迁移超过蛋白质分子。 而丧失夹击的作用；同时， 凝胶的孔径变小，降低了 蛋白质的迁移率。故蛋白 质分子在均一的电压梯度 和PH 值中泳动，依其分 子量的大小而分开。
2)
3)
实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全
打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋 白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰 凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成 亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常 或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。