实验二 新城疫病毒的鸡胚培养201506012
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理二、实验内容1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鲜种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释（20倍）,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
病毒鸡胚培养病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。
鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。
目前鸡胚尤其是SPF、鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。
除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。
[目的要求](1)掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的接种途径和接种方法。
(2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。
[实验材料]白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫工系和Ⅱ系弱毒苗等。
[实验准备]1．鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。
孵化条件一般选择相对湿度为60％，最低温度36℃，一般37．5℃。
《动物病毒学实验》课件：实验一 病毒在鸡胚中的培养
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚 接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
六、孵育
➢温度：37.5-38.5℃ ➢相对湿度：50%-60% ➢新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 ➢翻卵：从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死 胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1. 绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2. 尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3. 卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4. 羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
6.用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中， 周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用 石蜡密封。
8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病
实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测
实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测实验报告病毒的鸡胚培养及梯度检测篇一:实验五十动物病毒的鸡胚培养实验五十一动物病毒的鸡胚培养三、器材1(病毒痘苗病毒(Vaccinia virus)，鸡新城疫病毒(Necastle distase virus)。
2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5,碘酒，70,乙醇，镊子，剪刀，封蜡(固体石蜡加1,4凡士林，溶化)，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3.白壳受精卵 (自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好)。
四、操作步骤1(准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育(37?，相对湿度是45%~60%)，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。
2.接种(1)绒毛尿囊膜接种?将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
?用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形(每边约5~6mm)的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
?用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。
?用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室(图?—4)。
《鸡新城疫》课件
人员管理
限制人员进出养殖场，进 出人员需进行消毒和防护 。
药物治疗
抗病毒药物
如利巴韦林、阿糖腺苷等，可在 发病初期使用，抑制病毒复制。
抗生素治疗
用于预防和治疗继发感染，如头 孢菌素、氟苯尼考等。
中药治疗
如板蓝根、金银花等中草药，具 有清热解毒、抗病毒的作用。
CHAPTER
04
鸡新城疫的案例分析
典型案例介绍
《鸡新城疫》PPT课件
CONTENTS
目录
• 鸡新城疫概述 • 鸡新城疫的症状与病变 • 鸡新城疫的预防与控制 • 鸡新城疫的案例分析 • 结论与展望
CHAPTER
01
鸡新城疫概述
定义与特点
总结词
鸡新城疫是一种由新城疫病毒引起的急性、高度接触性传染病，主要感染鸡。
详细描述
鸡新城疫具有高度传染性和致死性，主要通过直接接触和空气传播，潜伏期一 般为3-5天。感染后，病鸡会出现高热、呼吸困难、咳嗽、下痢等症状，严重时 会导致死亡。
综合防治措施
采取综合防治措施，包括加强饲养管理、提高生物安全水平、定期 消毒等，降低鸡群感染鸡新城疫的风险。
对养殖户的建议
1 2 3
提高养殖技术与管理水平
养殖户应加强饲养管理，提高饲料营养水平，保 持鸡舍通风良好，降低饲养密度，减少应激因素 。
严格执行防疫程序
养殖户应按照兽医部门的指导，制定合理的防疫 程序并严格执行，确保鸡群得到及时、有效的免 疫保护。
CHAPTER
05
结论与展望
研究成果总结
鸡新城疫的病原学特征
鸡新城疫病毒属于副粘病毒科，具有包膜和特殊的病毒粒 子结构，主要通过呼吸道和消化道感染鸡群，引起鸡只死 亡和产蛋量下降。
鸡新城疫实验报告
鸡新城疫实验报告鸡新城疫实验报告引言：近年来，鸡新城疫成为了农业领域的一大难题。
鸡新城疫是由新城疫病毒引起的一种高度传染性疾病，对家禽养殖业造成了严重的经济损失。
为了更好地了解鸡新城疫的传播机制和防控措施，我们进行了一系列的实验研究。
实验一：病毒传播途径的探究我们选取了一批健康的鸡只，并将其分为多个实验组。
首先，我们在实验组A中注射了新城疫病毒，并将其与实验组B中的鸡只隔离。
结果显示，实验组A中的鸡只出现了明显的疾病症状，而实验组B中的鸡只则保持了健康状态。
这表明，鸡新城疫主要通过直接接触传播。
接着，我们进行了进一步的实验，将实验组A中的鸡只与实验组C中的鸡只共同放置在同一笼子中。
结果显示，实验组C中的鸡只也出现了鸡新城疫的症状。
这表明，鸡新城疫也可以通过空气传播。
实验二：病毒的抗体检测为了进一步研究鸡新城疫的传播机制，我们对实验组A中的鸡只进行了抗体检测。
实验结果显示，实验组A中的鸡只体内出现了新城疫病毒的抗体。
这表明，鸡新城疫病毒可以在感染后引起鸡只产生免疫反应，从而形成抗体。
实验三：疫苗的防控效果评估为了评估疫苗的防控效果，我们选取了一批健康的鸡只，并将其分为两组。
实验组A中的鸡只接种了新城疫疫苗，而对照组B中的鸡只则未接种疫苗。
随后，我们将实验组A和对照组B中的鸡只分别与感染新城疫病毒的鸡只接触。
结果显示，实验组A中的鸡只未出现明显的疾病症状，而对照组B中的鸡只则出现了鸡新城疫的症状。
这表明，新城疫疫苗对鸡新城疫具有一定的防控效果。
实验四：环境因素对病毒传播的影响为了研究环境因素对鸡新城疫的传播影响，我们进行了一系列的实验。
首先，我们在实验室中设置了不同温度和湿度的环境，并将感染新城疫病毒的鸡只放置在其中。
结果显示，高温和低湿度环境下，鸡新城疫的传播速度更快。
这表明，环境因素对鸡新城疫的传播起到了一定的影响。
结论：通过一系列的实验研究，我们对鸡新城疫的传播机制和防控措施有了更深入的了解。
鸡新城疫抗体检测实验报告
鸡新城疫抗体检测实验报告
引言
•鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）是一种由鸡新城疫病毒引起的急性、高度传染性疾病。
•对鸡新城疫的抗体检测是确保家禽养殖业安全和疫情控制的重要手段之一。
实验目的
•通过检测鸡群中的抗体水平，判断其是否感染了鸡新城疫病毒，从而进行及时的干预和控制措施。
实验方法
1.样本采集：
–从鸡群中选取一定数量的鸡只，代表样本群体。
–采集鸡只的血液样本，确保采样的无菌和无血栓。
2.抗体检测：
–使用ELISA技术或HI技术等方法，对血液样本中的鸡新城疫抗体进行检测。
–按照相关试剂盒说明书的步骤进行操作，确保准确性和可重复性。
3.结果分析：
–根据检测结果，对鸡群中抗体水平的高低进行评估。
–判断鸡群是否处于鸡新城疫感染风险中，从而制定相应的预防措施。
实验结果
•检测结果显示，样本群体中的抗体水平明显升高。
•鸡群中的抗体阳性率达到95%以上，为鸡新城疫感染的警戒线。
结论
•根据本次实验的结果，可以推断该鸡群已经感染了鸡新城疫病毒。
•建议立即采取相应的疫情控制措施，包括隔离感染鸡只、加强清洁消毒等。
展望
•随着科技的发展，抗体检测方法将更加准确和高效。
•将来可以探索更多的抗体检测技术，如PCR等，以提高鸡新城疫的早期检测和预防效果。
参考资料
•[鸡新城疫病毒抗体检测方法研究进展](
•鸡新城疫病毒抗体检测方法研究进展. 农业科学研究. 2020. •鸡新城疫病毒感染与抗体检测技术综述. 动物医学进展. 2018.。
实验二 新城疫病毒的鸡胚培养201506012
2、病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为 达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中 加青霉素和链霉素各100~500IU，置室温中1 小时或冰箱中12~24小时处理。或经滤器除 菌。
8
（二） 接种
1、钻孔 将选好的鸡胚气室向上置于蛋架上，在所标 记部位用经75%酒精棉球消毒的打孔器钻一 个小孔。 注意：恰好使蛋壳打通而又不伤及壳膜。
四实验内容和方法一接种前的准备二接种6三收获一接种前的准备1鸡胚的准备?选择911日龄的鸡胚在照蛋时以铅笔勾划出气室边界胚胎及主要血管位置在胚胎7出气室边界胚胎及主要血管位置在胚胎对侧距气室边界上或下约5mm处避开血管作标记作为接种部位
实验二
病毒的鸡胚培养
1
目的要求 基本原理 器材准备
14
五、思考题
1、用鸡胚培养病毒,在选用鸡胚时应注意什么问题? 2、以鸡胚尿囊腔接种培养病毒的操作过程中应注 意什么问题？ 3、鸡胚接种含有新城疫病毒的病料后，其死亡胚 体的有哪些病变特征，若接种48h后胚体未死，原 因是什么？ 4、为什么接种新城疫病毒后24小时内死亡的鸡胚 要丢弃，而不用于收获病毒？ 5、孵化鸡胚的过程中，为什么要翻蛋？ 6、用鸡胚增殖病毒时有哪些优缺点？
allantois embryo amnion yolk sac chorion albumen
11
尿囊腔接种法
12
3、封孔、孵育 注射接种物后用融化的石蜡或消毒胶布封闭 注射小孔。 将鸡胚气室朝上置于37℃温箱中孵育。 每天翻蛋两次，照视一次，24小时内死亡的 舍去。
13
（三）收获
实验内容和方法
思考题
2
一、目的要求
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
鸡胚
新城疫病毒的分离鉴定摘要：病毒的鸡胚培养要掌握病毒的鸡胚接种、收获方法，掌握病毒的血凝及血凝抑制试验的操作方法，掌握检测病毒毒价的方法。
通过血凝试验和血凝抑制试验表明血凝试验（第一排从第二个开始凝集）和α血凝抑制试验（第二排从第七个开始凝集）两排孔的血凝价相差5个滴度，所以结论是新城疫病毒为阳性。
关键词：新城疫血凝血凝抑制鸡胚引言：某些病毒如鸡的新城疫病毒、禽流感病毒、吐出血病毒等，具有凝集某种哺乳动物或禽类红细胞的特性，利用该特性进行的试验称病毒血凝试验。
血凝性是病毒的一种生物学特性，所进行的血凝试验不是特异性的血清学反应。
但病毒的这种血凝现象可被相应的特异性抗体所抑制，称之为血凝抑制试验，这一过程是抗原抗体的特异性反应。
新城疫病毒通常采用感染鸡胚尿囊液。
血凝和血凝抑制试验操作方法有全量法和微量法两种，但主要采用后者。
血凝抑制试验主要有α法和β法两种，通常采用后者，α法血凝抑制试验用来检测病毒抗原。
1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 待检病毒（新城疫病毒尿囊鸡胚液）、生理盐水、阳性血清（新城疫病毒抗体）、被检测血清。
1.1.2 离心机、试管或96孔V型微量滴定板、移液管或微量移液器等。
1.1.3 1％鸡红细胞1.2 方法1.2.1 鸡胚静脉接种：取12~13日龄的鸡胚在照蛋灯下标出血管位置，消毒后用钢锥小心钻开蛋壳，但不伤及壳膜。
滴灭菌液体石蜡少许，以提高壳膜透明度，并在照蛋灯下用细小针头进行静脉接种，注射量在0.1ml以内。
注射后会有少许出血，当即用蜡或无菌胶布封住。
1.2.2 微量血凝和血凝抑制试验1.2.2.1 取洁净96孔V形微量滴定板，用微量移液器从第一孔至第十二孔各加生理盐水50ul。
1.2.2.2 用微量移液器吸取新城疫病毒液50ul，加入第一孔并吹吸3~5次，使其与生理盐水充分混匀后，依次倍比稀释至第11孔，弃去50ul，第12孔不加病毒液作为对照。
1.2.2.3 用微量移液器在第一排每孔各加生理盐水50ul，第二排各加一定稀释度的新城疫病毒阳性血清50ul。
新城疫病毒在鸡胚中增殖影响因素探讨
新城疫病毒在鸡胚中增殖影响因素探讨李京培;毕克菊;苏世云;胡勇;方海红;王明丽【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2005(40)3【摘要】目的探讨新城疫病毒(NDV)Ⅱ系弱毒株在鸡胚内增殖产生血凝素的最佳条件.方法将NDV按一定浓度稀释接种到鸡胚内孵育48～72h,收获鸡胚尿囊液,测定血凝效价.结果选择9～11日龄鸡胚,种子病毒稀释10-2～10-3、接种剂量为0.2～0.3 ml;在36℃培养48～72 h时,其鸡胚尿囊液量多且血凝效价高.弱毒系产生的NDV血凝效价高于强毒系和C30克隆系病毒.鸡胚培养较鸡成纤维细胞培养产生的NDV血凝效价高.结论鸡胚的病毒接种量和孵育温度对NDV的血凝效价的影响很大,在研究NDV的血凝能力时应注意到这些问题.【总页数】4页(P222-225)【作者】李京培;毕克菊;苏世云;胡勇;方海红;王明丽【作者单位】安徽医科大学微生物教研室,合肥,230032;安徽医科大学微生物教研室,合肥,230032;安徽医科大学微生物教研室,合肥,230032;安徽医科大学微生物教研室,合肥,230032;安徽医科大学微生物教研室,合肥,230032;安徽医科大学微生物教研室,合肥,230032【正文语种】中文【中图分类】R373.9;R392.11【相关文献】1.板蓝根和黄芪提取液对鸡新城疫病毒在鸡胚上增殖的影响 [J], 侯卫东;黎婧;崔沛;李双亮;李双艳;高文明;李新生2.新城疫病毒在鸡胚中增殖特性的研究 [J], 孙荣华;田志军;张鹏;郭云雷3.板蓝根和黄芪提取液对鸡新城疫病毒在鸡胚上增殖的影响 [J], 侯卫东;黎婧;崔沛;李双亮;李双艳;高文明;李新生4.鸡胚接毒量对新城疫病毒LaSota株增殖的探究 [J], 胡江锋;胡春艳;张小娟5.新城疫病毒(NDV)在免疫鸡胚中增殖条件的优化 [J], 张兴晓;沈志强;马景霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
病毒的鸡胚培养法
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
实验二 鸡新城疫弱毒疫苗的制备
实验二鸡新城疫弱毒疫苗的制备新城疫又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触性传染病，其主要特征为呼吸困难、腹泻、神经紊乱及黏膜和浆膜出血，一年四季均可发生，为我国养鸡业的头号疾病。
预防和治疗所用的新城疫疫苗种类很多，大致包括灭活疫苗和弱毒疫苗两类。
下面以新城疫弱毒疫苗为例讲述其制备过程。
一、目的与要求1．掌握鸡新城疫弱毒疫苗的制备方法。
2．熟悉鸡新城疫弱毒疫苗制备的操作过程。
二、材料与试剂材料：种蛋、鸡胚孵化箱、冰箱、无菌操作台、手术镊子、注射器、蜡烛、酒精灯、酒精棉和碘酊等。
试剂：灭菌PBS液/生理盐水；青、链霉素溶液。
三、制备前准备1、种毒的选择：种毒属于弱毒力毒株，包括HB1株、F株、LaSota 株、LaSota-Clone30和N79株。
必须符合：①种毒对鸡胚的毒力。
以10倍稀释的种毒0.1ml尿囊腔接种10日龄鸡胚，鸡胚应于接种后24-120h内死亡70%以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上。
②种毒对1月龄雏鸡滴鼻免疫的最小免疫量应不大于10-3/1滴。
③种毒对10日龄鸡胚半数感染量（EID50）应不大于10-7/0.1ml。
④种毒对初生雏鸡不致病。
2、种毒的稀释：用灭菌PBS液或0.85%生理盐水10-4～10-6稀释种毒，稀释时最好加入适当双抗溶液，并在4℃作用约4小时。
3、鸡胚的选择：最好选用SPF胚、其次选用非免疫胚，再次选用普通胚。
四、操作过程1、将购买的种蛋放于37℃温箱中孵育，加入适量水调节湿度。
2、孵育至9～11日龄时，将鸡胚置于黑暗的环境下，在照蛋器下，可观察到明显的胚体运动、丰富的血管和气室，用铅笔划出接种部位和气室部位。
划线时要尽量避开胚头和血管（尤其是大血管）。
3、将划好的鸡胚置于经紫外线消毒过的超净台中，先用碘酊消毒，再用酒精棉脱碘；4、用手术镊子在标记部位打孔，打孔时要在接种部位和气室各打一孔。
5、用灭菌注射器吸取0.1ml～0.2ml稀释病毒液，经接种孔注入鸡胚尿囊腔中；6、用石蜡先将接种孔封口后，在将气室孔封口；7、做好标记（时间，名称），置37℃温箱中继续孵育，增殖病毒。
新城疫病毒(NDV)在免疫鸡胚中增殖条件的优化
新城疫病毒(NDV)在免疫鸡胚中增殖条件的优化
张兴晓;沈志强;马景霞
【期刊名称】《中国兽医学报》
【年(卷),期】2001(21)2
【摘要】新城疫病毒 ( NDV)在鸡胚中的增殖受母源抗体、接种日龄、培养时间、接种剂量、种毒及其稀释倍数、孵化温度、孵化湿度等因素的影响。
通过对 NDV 在免疫鸡胚中增殖条件的优化配置 ,得出如下结果 :1 0日龄的免疫鸡胚 ,在母源抗体较高的情况下 ( 7log2～ 9log2 ) ,接种种毒的稀释倍数为 1 0 0 0～ 50 0 0倍 ,经过一定孵育时段。
【总页数】2页(P117-118)
【关键词】新城疫病毒;免疫鸡胚;尿囊液量;血凝效价;孵化时间;增殖条件;灭活疫苗【作者】张兴晓;沈志强;马景霞
【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究所;山东省滨州地区畜牧局
【正文语种】中文
【中图分类】S898.315.3;S858.312.
【相关文献】
1.中药增效"病毒克"颗粒剂对NDV在鸡胚中增殖的影响 [J], 付旭东;李有良;王春涛;东贤;何立宁;吕洁;刘晓静
2.同胚增殖鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果观察及免疫应答反应 [J], 金梅林;陈焕春;何启盖;吴美洲;吴斌;陈维江;向大育
3.鸡传染性支气管炎病毒(IBV)与鸡新城疫病毒(NDV)在SPF鸡胚上的相互干扰作用 [J], 江国托
4.增效“病毒克”颗粒剂对NDV在鸡胚中增殖的影响 [J], 郑雪花;田勇;杨玉成;张煜;孙云社;许胜彩
5.NDV和H_9亚型AIV在血凝抑制及混合病毒在鸡胚增殖中的相互干扰 [J], 刘文博;丁炜东;孔晶;王海燕;胡顺林;何海蓉;张如宽;刘秀梵
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2株新城疫病毒的分离与鉴定
2株新城疫病毒的分离与鉴定【摘要】盐都、建湖两养殖户鸡群大批死亡，有呼吸道症状，拉稀。
剖检喉、气管内有大量黏液，盲肠扁桃体出血，腺胃乳头出血，脂肪肝，脾脏肿大，卵子明显变性，胰脏出血，疑似新城疫病例。
采集病鸡的肝，肠道等病变组织。
经处理后接种10日龄非免疫鸡胚，致死鸡胚。
取鸡胚尿囊液，做HA 试验，两样品均有血凝性，再用抗H5亚型禽流感病毒阳性血清、抗H9亚型禽流感病毒阳性血清和抗新城疫病毒阳性血清进行HI试验，结果显示仅抗新城疫病毒阳性血清对两样品有血凝抑制作用，说明分离到的病毒均为新城疫病毒。
通过MDT实验发现两地鸡群感染的新城疫病毒均为强毒株。
【关键词】鸡；新城疫病毒；分离；鉴定；血凝试验；血凝抑制试验综述新城疫（ND），也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病，常呈败血症经过，主要特征是呼吸困难，下痢，神经症状，黏膜和浆膜出血，腺胃黏膜出血具有诊断意义[1]。
感染鸡的呼吸道、循环系统、胃肠道紊乱及神经症状都很明显，蛋鸡可有突发性产蛋下降、产薄壳蛋或鸡蛋白蛋。
临床表现取决于宿主的年龄及其免疫状态、感染毒株的毒力及嗜性；一般潜伏期为5天[2]。
世界范围内曾经发生过4次大规模的流行。
首次大爆发源于东南亚和英国，从1926年到1960年，经过30多年的时间，从印泥和英国传遍了全世界。
第二次大流行始于20世纪60年代，从中东迅速传播到世界大部分国家，此次流行传播速度较快，原因是养禽业已经拓展为国际贸易，空中运输禽类及珍禽类是此次流行的重要传媒。
第三次流行始于1974年前后，疫源地尚无定论，但由于疫苗的推广使用，使得引起疫病流行的病毒更加复杂[3]。
第四次流行始于20世纪70年代晚期，源于中东，传染源是鸽副黏病毒I型，1981年传至欧洲，然后迅速传遍世界，并流传至今[4]。
特别是20世纪90年代后，该病在欧洲、亚洲许多国家发生，对养禽业造成了巨大的损失。
特别值得关注的是鹅的NDV感染，在1997年以前，几乎没有鹅感染NDV 发病的报导，即使人工攻毒，水禽的发病率和致死率也较低。
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的要求掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。
二、器材1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。
实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。
2.接种材料新城疫I系疫苗3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。
三、内容和方法（一）接种前的准备1.鸡胚的准备本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、 1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。
2.病毒接种材料的准备要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1小时或冰箱中12—24小时处理。
或经滤器除菌。
（二）接种绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。
（三）收获新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。
收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。
碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存。
病毒学检验 第二章 鸡胚和动物接种技术2015
适用于大多数教学和科研 实验。
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3、无特定病原体动物(SPF)
三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的 病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病的 病原体。
目前国际公认的标准级别的实验动物。
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饲养管理：SPF动物必须饲养在温湿度衡定的空气净化
预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细
胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可 用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。
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2、绒毛尿囊膜接种
牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，可在 膜上可形成斑点状或痘疱状病灶。
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卵壳与壳膜
卵壳位于最外层的坚硬壳层 壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换
气室
功能主要是呼吸和调节压力
绒毛尿囊膜
壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官
羊膜
胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。
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尿囊腔
位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器官；含5－20ml尿囊液
二、鸡胚的孵育
孵育的温度
孵育的湿度 翻卵
通风
38℃～39℃
40％～70％ 每天180°转动鸡胚1～2次
排出CO2，吸入O2
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鸡卵
卵白 卵黄 系带 胚盘
发育中的胚胎
发育中的胚胎
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破壳而出的小鸡
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（三）收获
接种后在温箱培养24 ~ 48小时即可收获。 收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏6小时或过夜，以免 收获时血管破裂。 收获前用碘酒、酒精消毒蛋壳，用镊子去除蛋壳和 壳膜，撕破绒毛尿囊膜而不破羊膜。 用灭菌镊子轻轻按住胚胎，以灭菌吸管或注射器吸 取尿囊液，装入灭菌容器内。多时可收集5 ~ 8ml/ 枚鸡胚。 如有血细胞应以2000r/min离心15min, 取上清液做 血凝试验。
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实验二
病毒的 器材准备
实验内容和方法
思考题
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一、目的要求
掌握病毒的鸡胚接种。 掌握鸡胚增殖病毒后的收获方法。 掌握病毒血凝价的测定及判定。
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二、基本原理
鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化 程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和 动物病毒的生长增殖；
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（一）接种前的准备
1、鸡胚的准备 选择9～11日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划 出气室边界、胚胎及主要血管位置，在胚胎 对侧距气室边界上或下约5mm处避开血管作 标记，作为接种部位。 用2 ～ 5%碘酊对接种部位进行消毒，用75% 酒精再擦一遍。
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2、病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为 达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中 加青霉素和链霉素各100~500IU，置室温中1 小时或冰箱中12~24小时处理。或经滤器除 菌。
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（二） 接种
1、钻孔 将选好的鸡胚气室向上置于蛋架上，在所标 记部位用经75%酒精棉球消毒的打孔器钻一 个小孔。 注意：恰好使蛋壳打通而又不伤及壳膜。
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2、绒毛尿囊腔内注射 ①用1ml注射器抽取接种物，45°角斜刺入 小孔1.5cm达尿囊腔内，注入接种物 0.1 ~ 0.2mL。 ②在距气室底边0.5cm处打一小孔，由此孔 进针1~1.5cm注射接种物0.1~ 0.2mL。
对接种的病毒不产生抗体。
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三、器材准备
鸡胚：9～11日龄非免疫ND疫苗种鸡所产的
白壳鸡胚。 接种材料：新城疫LaSota株。 器械：孵卵器、照蛋器、蛋架、打孔器、铅 笔、 1ml注射器、3%碘酊、75%酒精棉球、 蜡烛、剪刀、镊子、灭菌的离心管、平皿等。
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四、实验内容和方法
（一）接种前的准备 （二）接种 （三）收获
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五、思考题
1、用鸡胚培养病毒,在选用鸡胚时应注意什么问题? 2、以鸡胚尿囊腔接种培养病毒的操作过程中应注 意什么问题？ 3、鸡胚接种含有新城疫病毒的病料后，其死亡胚 体的有哪些病变特征，若接种48h后胚体未死，原 因是什么？ 4、为什么接种新城疫病毒后24小时内死亡的鸡胚 要丢弃，而不用于收获病毒？ 5、孵化鸡胚的过程中，为什么要翻蛋？ 6、用鸡胚增殖病毒时有哪些优缺点？
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禽胚结构
shell air pocket
outer shell membrane
allantois embryo amnion yolk sac chorion albumen
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尿囊腔接种法
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3、封孔、孵育 注射接种物后用融化的石蜡或消毒胶布封闭 注射小孔。 将鸡胚气室朝上置于37℃温箱中孵育。 每天翻蛋两次，照视一次，24小时内死亡的 舍去。