实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程
rtqpcr计算方法
rtqpcr计算方法实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR），也被称为rtqPCR，是一种在生物医学研究中广泛应用的分子生物学技术。
该技术利用荧光标记的探针或者特定的荧光染料，对PCR过程中的产物进行实时监测，通过荧光信号的强弱来实时反映DNA的扩增情况，从而实现对DNA的定量分析。
rtqPCR具有高灵敏度、高特异性和高精度的特点，因此在基因表达分析、突变检测、基因定位等领域有着广泛的应用。
一、实验步骤1. 样品处理：提取待测样品的DNA，进行PCR扩增。
2. 荧光标记：在PCR反应体系中加入荧光标记的探针或者荧光染料。
3. 实时监测：PCR反应过程中，荧光信号被实时监测，并记录荧光信号的变化情况。
4. 数据分析：通过对比标准品或者内参基因的荧光信号，计算待测样品的基因表达量或者DNA拷贝数。
二、荧光染料及探针荧光染料：荧光染料是一种能够吸收特定波长的光并发出另一波长的光的物质，常用于标记DNA或RNA。
在rtqPCR中，常用的荧光染料包括SYBR Green和TaqMan。
SYBR Green是一种通用的染料，可与所有dsDNA结合并产生荧光，因此其特异性较差。
而TaqMan探针是一种专一的荧光染料，其特异性好，因此在基因突变和单核苷酸多态性（SNP）检测中应用广泛。
探针：探针是一种标记有荧光的特异性寡核苷酸片段，可与靶基因结合。
在PCR过程中，随着DNA的扩增，探针与靶基因的结合量增加，从而产生更多的荧光信号。
常用的探针包括TaqMan探针和分子信标。
TaqMan探针是一种较长的寡核苷酸片段，能够与靶基因进行高特异性结合。
分子信标则是一种更短的寡核苷酸片段，与靶基因的结合区域较短，因此具有更高的特异性。
三、数据分析数据分析是rtqPCR实验中非常重要的环节，通过对荧光信号的变化情况进行分析，可以计算出待测样品的基因表达量或者DNA拷贝数。
常用的数据分析方法包括相对定量和绝对定量。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
荧光定量pcr步骤
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
real time RT-PCR
Molecular Beacons
发夹型杂交探针
Molecular Beacons
原理：荧光谐振能量传递（ 原理：荧光谐振能量传递（FRET） ）
环
环与目标序列完全配对
茎
荧光素
茎由互补配对的序列组成
淬灭剂
Molecular Beacons 优点
对目标序列有很高的特异性 ——SNP检测最灵敏试剂之一 SNP检测最灵敏试剂之一 SNP 荧光背景低
朱红 空白 87.3
HC 、HSC 2d 1 HSC 4d 、 HSC 2d 2 88.3
63度20s 度
HSC 2d 1 、 HSC 4d 88.3
65度20s 度
标准曲线制备
体外转录RNA 体外转录 体外合成ssDNA 体外合成 纯化的质粒dsDNA 纯化的质粒 cDNA PCR产物 产物 将待测基因的PCR产物用胶回收试剂盒进 将待测基因的 产物用胶回收试剂盒进 行纯化，然后按10倍梯度稀释即可得到标 行纯化，然后按 倍梯度稀释即可得到标 准品，用于做标准曲线。 准品，用于做标准曲线。
Molecular Beacons 缺点
设计困难
只能用于一个特定的目标 价格较高
TaqMan
TaqMan
荧光素 淬灭剂
探针
水解型杂交探针
TaqMan
目标特异性探针 5’ 为荧光素， 3’ 为淬灭剂
5’ 荧光素 3’淬灭剂
与目标序列互补
TaqMan
R F Q R
工作原理
报告基团被淬灭
R 报告基团 Q 淬灭基团
Ct值的概念 Ct值的概念
Ct值的定义是 值的定义是PCR扩增过程中 ， 扩增产物 扩增过程中， 值的定义是 扩增过程中 (荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期） 荧光信号） 荧光信号 到达阈值时（进入指数增长期） 所经过的扩增循环次数 所经过的扩增循环次数
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
rt-qPCR实验操作
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[内参]=均一化的目的基因表达量
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指 数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。 但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗， 最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进 入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在 指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明 确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N= 循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确 推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关 系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多 少是不准确的。
1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和 使用的内参序列，排好板的顺序。 2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离 心。 3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、 水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物 各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。 按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微 升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每 孔1.6微升。 5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后输出 对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
实时荧光定量PCR仪操作流程
实时荧光定量PCR仪操作流程实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种常用的分子生物学实验仪器，用于定量检测DNA或RNA样本中的特定序列。
通过对PCR反应进行荧光检测，可以实时监测目标序列的扩增过程，并且具有高灵敏度和高特异性的优势。
下面将介绍实时荧光定量PCR 仪的操作流程，以帮助您正确进行实验。
1. 准备工作在开始实时荧光定量PCR实验之前，需要准备以下实验器材和试剂：（1）实时荧光定量PCR仪：确保仪器已预热至适当的温度；（2）PCR反应管或板：根据实验需要选择适当的规格；（3）PCR试剂盒：包括DNA模板、引物、探针、酶等；（4）DNA/RNA样本：按照实验设计合理稀释或提取，确保样本质量良好；（5）聚合酶链式反应混合液（PCR Mix）：根据试剂盒说明配置混合液。
2. 操作步骤（1）设置PCR仪参数：将需要的实验参数输入PCR仪中，包括扩增阶段的温度、时间和循环次数等。
（2）制备PCR反应体系：按照试剂盒说明书中的配方将PCR Mix、DNA模板、引物和探针等加入PCR反应管或板中。
（3）密封反应管或板：确保反应管或板密封良好，避免样品蒸发或污染。
（4）放入PCR仪：将密封好的PCR反应管或板放入PCR仪中，确保仪器已预热至适当的温度。
（5）运行实验：启动PCR仪，开始实时荧光定量PCR反应。
仪器会根据设置的参数自动进行温度循环和荧光信号监测。
（6）数据分析：实验进行过程中，可以通过PCR仪的软件实时监测扩增曲线和荧光信号，获得相关的实验数据。
（7）结果解读：根据实验目的和结果，对荧光信号和扩增曲线进行分析和解读，获得所需的定量PCR结果。
3. 注意事项（1）实验操作应按照严格的无菌操作要求进行，避免PCR反应受到外部污染。
（2）实时荧光定量PCR仪涉及的试剂和标本具有一定的生物安全风险，应按照相关安全规范进行操作和处理。
（3）准确的数据记录和标注是保证实验结果可靠性的重要环节，务必在实验过程中进行详细记录。
实时荧光定量步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤关键词：实时荧光PCR2012-03-09 16:43来源：互联网点击次数：467381 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。
样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量pcr的技术原理
实时荧光定量pcr的技术原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种可以在PCR反应过程中实时监测DNA扩增的方法。
其技术原理基于PCR反应中的DNA扩增和荧光探针的结合。
实时荧光定量PCR主要包括以下步骤：
首先，将待扩增的DNA模板，引物和荧光探针混合在一起。
荧光探针由一个与待扩增的DNA序列相互补的引物和一个带有荧光染料和一个抑制退火的小分子的探针组成。
接着，将混合物加入到特定设计的PCR反应体系中，其中包括缓冲液、DNA聚合酶以及其他所需的试剂。
PCR反应开始后，通过热循环过程，将DNA模板的两条链分离，并进行DNA扩增。
在PCR反应过程中，荧光探针与DNA扩增产物结合，当探针结合到合适的位置上时，荧光探针的荧光染料会释放出荧光信号。
PCR反应体系中含有一个光学系统，可以实时监测PCR反应进行过程中的荧光强度变化。
光学系统通常由一个光源、一个荧光探测器和一个数据处理单元组成。
实时荧光定量PCR中的数据处理单元会收集、分析和解释荧光强度变化的数据，根据扩增产物的荧光信号强度，可以推断
出反应体系中的扩增产物的绝对或相对数量。
通过定量PCR技术，可以对DNA进行定量分析，确定起始模板的数量。
实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、拷贝数变异检测等领域得到广泛应用。
实时荧光定量PCR注意事项及原理(Q-RT)
1)Livak法，即2-△ △ Ct法
条件：目标基因和参照基因扩增效率都接近100%，且相互间效率偏差在5%以内。 首先，用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值， △Ct(test)= Ct(target，test)- Ct(ref，test) △Ct(calibrator)= Ct(target，calibrator)- Ct(ref，calibrator) 其次，用校准样本的△ Ct值归一试验样本的△ Ct值， △ △Ct= △Ct(test)- △Ct(calibrator) 最后，计算表达水平比率， 2-△ △ Ct=表达量的比值
A3：如果待测样本的Ct值高于标准曲线上最低浓度的标准品的Ct值， 增加待测样本量重做实验。
例如：
5 4 3 2 1
无扩增
低表达。通常基因表达检测所需的 cDNA 量为 1 到 100 ng。但
是如果目的基因的丰量的样本中很低，可能就需要更多的样本 量。
反转录问题。检查您的反应中的各组分，通过优化各组分提高 扩增效率。
荧光报告基团:
双链 DNA (dsDNA) 结合染料：SYBR Green I，非特异性结合
在游离状态下,SYBR Green I 发出微弱的荧光,但一旦与dsDNA 结合,其荧光增加1000 倍。
工作原理:
x-轴表示PCR循环数； y-轴表示扩增反应的荧光值,与反应管中扩增产物的量有比例关系
NTC 扩增
当引物二聚体形成时，如果使用与 DNA 双链结合的染料，在
NTC 反应中也可观察到荧光信号。
另一种情况，在存在污染物的情况下，在 NTC 孔中也可看到晚 期扩增。如果由于加样错误引起是一种随机事件，并不是所有 NTC 都会出现扩增。如果在每一个 NTC 反应里都出现扩增，很 可能是其中一种或两种试剂被污染了。
RT-qPCR(实时荧光定量PCR)
• 2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹
探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成 。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产 生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信 号。
• 3、Amplisensor 双链信号引物，进行半巢式扩增
；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构 被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消 失，产物量与荧光成反比。
4. 反应Buffer体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6. 其他与常规PCR相同
优 点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜
缺 点
容易与非特异性双链DNA结合，产 生假阳性，但可以通过融解曲线的分
1
RT-qPCR 原理----绝对定量
R2为相关系数：R2>0.99时，认为 两数值之间相关性好。 E为扩增效率：一般认为在90%110%之间数据可用。 Logo
1
2.相对定量
RT-qPCR 原理----相对定量
病人内参 基因 Ct a
病人目的 基因 b
对照内参 基因 c
对Байду номын сангаас目的 基因 d
������−∆∆������������ = ������−(∆������������������−∆������������������) = ������−[
������−������ −(������−������)]
结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。
Logo
RT-qPCR 原理----融解曲线
荧光强度
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程与规范
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程与规范⼀、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适⽤不同的提取⽅法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较⾼，所以，正式实验前要选择⼀款适合⾃⼰样品的提取⽅法，在实验过程中要防⽌RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进⾏RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要⽤DNase I进⾏消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加⼊适量RNA酶抑制剂）。
⼆、DNase I 消化样品RNA 中的DNA⽤DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA)10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O ⾄100ul混匀，37℃ 90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放⼊三⾓瓶中，向其中加⼊4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC⽔，放微波炉⾥溶化。
2）待冷却到60摄⽒度左右时，加⼊1ml甲醛，摇匀（避免产⽣⽓泡）。
倒⼊凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加⼊6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加⼊变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
⽤凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所⽰。
可见28S和18S两条明亮条带，⽆DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例)组份加量(20ul体系)加量(40ul体系)模板(RNA)0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整)3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O⾄12.5ul⾄25ul混匀，70℃ 5min，⽴即冰浴5*buffer 4.0ul8.0ul dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul RNase Inhibitor0.5ul 1.0ul混匀，37℃ 5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃ 60min ，70℃ 10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求：1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终⽌的序列⽽难以拷贝其全长序列时，可采⽤随机六聚体引物这⼀不特异的引物来拷贝全长mRNA。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于精确测量DNA 或RNA样本中特定目标序列数量的分子生物学技术。
该方法结合了传统PCR 技术和荧光探针技术，可以在PCR反应过程中实时监测和定量特定目标序列的扩增量。
实时荧光定量PCR的步骤如下：
1. 准备反应体系：包括特定目标序列的引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、酶和DNA模板。
2. PCR反应：将反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。
PCR过程中，引物与DNA模板结合，酶进行DNA合成，目标序列得到扩增。
3. 荧光探针监测：在PCR反应中，荧光探针与目标序列结合，产生荧光信号。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的强度。
4. 数据分析：实时荧光定量PCR仪会根据荧光信号的强度，通过计算机算法来计算目标序列的起始数量。
可以利用标准曲线法或相对定量法进行数据分析，得到目标序列的绝对或相对数量。
实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和广泛线性范围等优点，
广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因表达分析等领域。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR详细操作步骤1.实验前准备a.首先，准备所需的引物和探针。
引物是用于扩增待测DNA或RNA序列的短链DNA片段，而探针是荧光标记的DNA分子，用于标记和检测扩增产物。
可以使用商业引物和探针，或者设计自定义的引物和探针。
b.准备样品。
样品可以是DNA或RNA提取物，也可以是cDNA反应产物。
确保样品的质量和纯度，避免污染和降解。
c. 准备Master Mix。
Master Mix是一个预混合的反应液，包含引物、探针、核酸酶、逆转录酶、聚合酶和其他所需的试剂。
根据实验设计确定Master Mix的配方和浓度。
2.反应管设定a. 将适量的Master Mix加入每个反应管中。
根据实验设计，确定每个反应管中所需Master Mix的体积。
b.加入适量的模板DNA或RNA溶液。
根据实验设计，确定每个反应管中所需模板溶液的体积。
c.加入适量的引物和探针。
根据实验设计，确定每个反应管中所需引物和探针的体积。
d.加入适量的缓冲溶液和其他试剂。
根据实验设计，确定每个反应管中所需缓冲溶液和其他试剂的体积。
3.PCR程序设定a.设定PCR程序。
根据引物和探针的特性，确定PCR程序的温度和时间参数。
通常包括一个初始变性步骤（95°C，5分钟），40个循环的扩增步骤（95°C，30秒；温度调节，30秒；扩增，30秒-1分钟），以及最终的降温步骤（4°C或25°C）。
b.设定数据采集方式。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，并实时记录和分析数据。
根据实验设计和PCR程序，选择合适的数据采集方式，在合适的时间点记录荧光信号。
4.实验操作a.将反应管安置在实时荧光定量PCR仪中。
确保反应管正确放置在PCR仪的样品槽中，并密封好。
b.启动PCR程序。
根据PCR仪的操作说明，启动PCR程序并开始反应。
c. 监测PCR反应过程。
实时观察PCR反应过程中的荧光信号变化。
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实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃ 90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。
2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。
倒入凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所示。
可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃ 5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃ 5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃ 60min ，70℃ 10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：① Tm=55-65℃② GC=30-80%③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。
对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。
五、cDNA与引物质量检测取0.2ml薄壁PCR管，编号。
向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物浓度10uM），向管中加入混合的cDNA各1ul。
各管补加水至20ul。
组份加量2×PCRTaqMix 10ul10uMPrimer FW 0.5ul10uMPrimer RV 0.5ulTemplate DNA 1ulddH2O 混匀至20ul混匀，置于TP600PCR仪中。
95℃ 5min；95℃15s，60℃35s ，40cycles；72℃ 5min；4℃ pause。
取扩增产物各8μl，DL2000 分子量标准5μl/泳道。
1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。
常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA 等。
因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
七、定量 PCR检测：取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。
向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。
一管中不加模板用作阴性对照。
各管补加水至25ul。
组份加量模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul10uM 引物F/R 0.5ul2×qPCR Mix 12.5ulddH2O 11.0ul混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。
95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s（荧光检测），40cycles。
荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。
八、扩增曲线和溶解曲线溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免；若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能：①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物；②在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰（只在引物跨内含子时存在），出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA；③扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。
2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000 拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。
2-△△CT方法的推导（详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量）补充：在DNase I 消化样品RNA 中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。
1. 向离心管中加入等体积氯仿（约300ul），剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。
4℃14000 rpm离心8min，取上清（约250ul）。
2. 加入1/10体积的NaAC（3M）（约25ul）和预冷的等体积异丙醇（约280ul），-20℃放置20min。
3. 4℃14000 rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。
4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。
5. 瞬时离心，用200ul（或10ul）的枪头小心吸去离心管底的残存液态（勿吸到管底的沉淀）。
6. 把离心管放置于超净台晾至约5-10 分钟（勿完全干燥，否则很难溶）。
加入30~50μl 的无RNase的水，静止1min 后，振荡30sec，瞬时离心。
7. 将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。