去内毒素的方法及检查方法
医疗用品中内毒素检测标准
医疗用品中内毒素检测标准一、检测方法医疗用品中的内毒素检测应采用鲎试剂法。
鲎试剂法是一种利用鲎血变形细胞溶解物与内毒素产生凝集反应的检测方法，具有灵敏度高、特异性强的特点。
二、灵敏度要求内毒素检测的灵敏度要求应达到0.1 EU/ml或更低。
这意味着在每毫升医疗用品中，内毒素的含量应不超过0.1 EU。
三、准确性要求内毒素检测的准确性要求较高，误差率应不超过±20%。
同时，应采用已知浓度的标准品对检测方法进行校正，以保证检测结果的准确性。
四、特异性要求内毒素检测应具有良好的特异性，避免与其他物质发生交叉反应。
对于医疗用品中可能存在的其他成分，应在检测时进行特异性验证，以确保结果的可靠性。
五、重复性要求内毒素检测的重复性要求较高，应采用多份样品进行平行试验，并计算变异系数（CV）。
CV值应不超过20%，以保证检测结果的稳定性和可重复性。
六、线性范围内毒素检测的线性范围应满足医疗用品中内毒素含量的要求。
线性范围的下限应达到灵敏度要求，上限应根据实际需要确定，一般可达到10 EU/ml或更高。
七、稳定性要求内毒素检测试剂的稳定性要求较高，应在规定的有效期内使用。
同时，应定期对试剂进行质量检查，以保证检测结果的可靠性。
八、操作简便性内毒素检测的操作应简便易行，不需要特殊设备和技能。
在操作过程中，应严格按照说明书进行操作，避免误差和偏差。
九、试剂安全性内毒素检测试剂应安全可靠，不会对操作者和环境造成危害。
同时，试剂的储存和运输也应注意安全问题，防止意外事故的发生。
十、符合国家相关法规和标准医疗用品中内毒素检测标准应符合国家相关法规和标准的要求。
具体来说，应遵循国家食品药品监督管理总局发布的《医疗器械注册管理办法》、《医疗器械监督管理条例》等法规的要求，以及国家标准化管理委员会发布的相关标准。
同时，还应关注国际上的相关法规和标准，以便与国际接轨。
《细菌内毒素检查》课件
其他检测方法
热原质鲎试剂盒法
利用鲎试剂与内毒素结合后加热，通 过凝胶形成或浊度变化来检测内毒素 的含量。该方法适用于注射剂、输液 等样品。
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离内毒素， 通过紫外吸收或荧光检测器来检测内 毒素的含量。该方法适用于生物制品 、血液制品等样品。
03
细菌内毒素检查的应用
实验后的处理和安全防护
废液的处理
实验后产生的废液应按照实验室规定进行处理， 不得随意倾倒或排放。
实验垃圾的处理
实验后产生的垃圾应按照实验室规定进行分类和 处理。
ABCD
仪器的清洗和维护
实验后应对使用的仪器进行清洗和维护，以确保 其性能和精度。
个人防护
实验人员应穿戴个人防护装备，如实验服、手套 、口罩等，以降低交叉污染和感染的风险。
饮用水监测
01
通过细菌内毒素检查，可以检测饮用水中的细菌内毒素含量，
确保饮用水安全。
污水处理监测
02
在污水处理过程中，对出水进行细菌内毒素检查，可以评估污
水处理效果和出水质量。
环境样品监测
03
对土壤、空气等环境样品进行细菌内毒素检查，可以了解环境
中的细菌污染状况，为环境治理提供依据。
04
细菌内毒素检查的注意事 项
开发新型检测方法和技术
开发多组分检测技术
将多种细菌内毒素相关分子同时纳入检测范围，实现多组分的同 时检测，提高检测效率和准确性。
开发新型免疫学检测方法
利用新型免疫学技术，如单克隆抗体、免疫磁珠等，提高检测的特 异性和灵敏度。
开发新型生物信息学技术
利用生物信息学手段，对细菌内毒素相关基因和蛋白质进行高通量 筛选和鉴定，为新型检测方法的开发提供有力支持。
细菌内毒素检查法和操作规程
******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人QC检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
细菌内毒素的耐热性及去除方法
细菌内毒素的耐热性
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。
其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。
而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
细菌内毒素的除去方法
由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。
对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干热灭菌方法。
内毒素检查-PPT
鲎试剂灵敏度复核
加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂 直放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟。
❖ 结果观察
将试管轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并 且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成 的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
阳
阴
性
性
❖ 计算
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性 ，阴性对 照为阴性 时实验为 有效，按 下式计算 反应终点 浓度的几 何平均值 即为鲎试 剂灵敏度 的复核结 果。
干扰实验
加样 准备好的36支鲎试剂放在试管架上，按下图加样。
干扰实验
0.1ml内毒素标准液 0.1ml检查用水
0.1ml含内毒素的供试品液 0.1ml供试品液
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生 气泡，放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观察 并记录结果。
实 验 结 果 计算 如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴 性，阴性 对照4管均 为阴性时 ，按下式 计算用检 查用水制 成的内毒 素标准溶 液的反应 终点浓度 的几何平 均值（Es ）和用供 试品溶液 或稀释液 制成的内 毒素溶液 的反应终 点浓度的 几何平均 值（Et）。
❖
刻度吸管、凝集管（10×75mm） 、三角瓶 、小试管 （16×100m m）、 试管架、 洗耳球、 封口膜或 金属试管 帽、时钟 、脱脂棉 、吸水纸 、剪刀砂 轮。
❖
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并 且对试验 无干扰的 器械（目 前多为无 热原的一 次性用品 ）。
鲎试剂灵敏度复核
。
2、 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水 溶解其内 容物，用 封口膜将 瓶口封严 ，置漩涡 混合器上 混合15分钟 。然后进 行稀释， 制备成4个浓度的 细菌内毒 素标准溶 液，即 2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度 ）四个浓 度的内毒 素标准溶 液，每稀 释一步 均应在旋 涡混合器 上混匀30 秒钟
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理去检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用eu/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标注值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水熔化，在旋涡混合器上搅匀15分钟，然后做成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每吸收一步均应当在旋涡混合器上搅匀30秒钟。
抢分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复水溶性后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18两支，其中16管分别重新加入0.1ml相同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行搞4管；另外2管重新加入0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。
将试管中溶液轻轻搅匀后，半封闭管口，横向放进37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最小浓度2λ管均为阳性，最高浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效率。
按下式排序反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测量值(λc).λc=1g-1(∑x/4)式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度就是指系列递增的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
阻碍试验按表中1制取溶液a、b、c和d，采用的供试品溶液应属未检验出来内毒素且不少于最小有效率吸收倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度为丛藓科扭口藓核试验项下操作方式。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转 180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。
举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:
平行 管数
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
1 2 3 4
0.25 + + + +
0.125 0.06 + + + + + -
0.03 -
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
方法学验证—供试品干扰预试验
（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委
员会编制的《临床用药须知》来确定最大剂量。 如 儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为 准。 （2）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗 心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药 品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2 或1/3。
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，
已经广泛的被世界各国药典收载。
成品检查——药品安全性检查之一 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废
二、细菌内毒素检测方法
《中国药典》批准使用方法： 测定 方法
细菌内毒素检测方法
（85）细菌内毒素检查法✹本章内容已与《欧洲药典》和/或《日本药局方》相应的内容统一，不一致的部分用符号（✹✹）标记。
✹细菌内毒素检查法（BET）系利用鲎试剂（美洲鲎或中国益）检测或量化革兰阴性菌产生的细菌内毒素。
可采用三种技术进行细菌内毒素检查：基于凝胶形成的凝胶法；基于内源性底物裂解后浊度变化的比浊法；基于合成胁显色基质复合物裂解后发生颜色变化的显色法。
可采用上述任意一种方法进行检测。
当对测定结果有怀疑或争议时，除另有规定外，以凝胶法测定结果为准。
本法操作过程中应防止内毒素的污染。
器具应按照经过验证的程序将所有玻璃器皿和其他热稳定材料置于干热烤箱中去除热原。
✹①✹通常使用的最低温度和最短时间为250℃加热30分钟。
如果使用多孔板和微量加样器吸头等塑料器具时，只有证明其不含有可检出的内毒素并对试验无干扰方可使用。
（注：本章中的“管”包括微孔板中的孔等所有反应容器。
）试剂和试液试剂是由鲎（美洲鲎或中国鲎）的阿米巴细胞（白细胞）溶解产物制得的冻干品。
这种试剂必须是按照权威机构认定的规程生产的产品。
（注：除内毒素外，鲎试剂也与P葡聚糖反应。
通过消除G因子或抑制G因子反应系统，能够制得不与葡聚糖反应的鲎试剂，此种鲎试剂可用于葡聚糖存在情况下的内毒素检查。
）内毒素检查（BET）用水在检测限内不与鲎试剂产生凝集反应的注射用水或用其他方法制备的水。
鲎测试液将鲎试剂溶解于内毒素检查用水或鲎试剂生产企业推荐的缓冲液中，轻轻混匀。
复溶的鲎试剂须按照生产企业的规定冷藏或冷冻保存。
溶液的制备内毒素标准品贮备液使用经现行WHO国际内毒素标准品标定过的美国药典内毒素标准品配制内毒素标准品贮备液。
按照包装说明书和标签上的规定制备、贮存贮备液。
内毒素的单位用EU表示。
[注：1个美国药典内毒素单位（EU）等于1个国际内毒素单位（IU）]内毒素标准品溶液将内毒素标准品贮备液充分混匀后，用内毒素检查用水进行连续稀释。
为避免因内毒素的吸附而导致失活，配制后的稀释液应尽快使用。
内毒素检测方法
内毒素检测方法一、内毒素的检测方法常用的检测内毒素的方法有以下几种：1.凝胶法：通过鲎试剂（鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）与内毒素发生凝集反应产生凝固蛋白（凝胶）的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
2.动态浊度法；浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
内毒素与鲎试剂中的凝固酶原激活呈凝固酶，凝固酶可使凝固蛋白原变成凝固蛋白（即产生凝胶），使液体的浊度发生变化，通过动态观察浊度变化速率检测。
3.终点显色法:通过由于细菌内毒素激活鲎试剂（鲎试剂中含有C 因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质（含N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐），使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。
4.动态显色法:内毒素可激活鲎试剂引起一系列酶促反应，产生黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm），在一定时间内，动态观察对硝基苯胺（pNA）的生成量，与细菌内毒素浓度成正相关。
但此方法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。
5.其他检测方法：还有一些直接测定内毒素定量的方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫学方法（如火箭免疫电泳试验法、L-聚赖氨酸法、双抗体夹心法、荧光偏振法等）等，这些方法的特点是特异性、准确性高，但其应用尚待大量临床实践的验证，操作尚待进一步简化；还有一些间接测定的方法，如生物学方法利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF，通过间接测定IL-1、TNF等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量；化学发光法：应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量；流式细胞术：应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。
2020药典细菌内毒素检查法
2020年的药典中有多种方法可用于检测细菌内毒素，以下是其中一些常见的方法：
杂交酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种常用的定性和定量检测方法，可以用于测定细菌内毒素的存在和浓度。
该方法利用特异性抗体与目标内毒素结合，并通过酶标记来检测反应的产物。
液相色谱-质谱联用（LC-MS）：LC-MS是一种高灵敏度和高选择性的分析技术，可用于细菌内毒素的检测和鉴定。
该方法将样品通过液相色谱分离，然后与质谱仪相连，通过质谱仪的检测来确定内毒素的存在和浓度。
生物学方法：一些生物学方法也可用于检测细菌内毒素，如小鼠致死试验和细胞毒性试验。
小鼠致死试验通过注射待测样品到小鼠体内，观察小鼠的生存情况来判断内毒素的存在。
细胞毒性试验则使用细胞培养体外模型，通过观察细胞的存活情况来评估内毒素的毒性。
凝胶凝集试验：凝胶凝集试验是一种常用的定性检测方法，通过将内毒素与抗体反应，在凝胶中观察反应的凝胶凝集情况来判断内毒素的存在与否。
GMP-细菌内毒素检查操作规程
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。
4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。
4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
细菌内毒素检查标准操作规程
范围：注射用水、大输液、化学药品、生化药品、放射性药品、生物制品等以及药品生产过程的内毒素监控。
职责：检验室对本规程的实施负责正文：1.操作前准备1.1检验人员操作前要穿戴好工作服、工作帽、戴上口罩，手要用75%的酒精消毒。
操作时要力求准确。
1.2设备与用具——试验所用器皿，需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时（或180℃干烤至少2小时）。
1.3试剂与标准品1.3.1无热原水：内毒素含量不超过0.06Eu/ml的注射用水。
1.3.275%酒精棉1.3.3鲎试剂为冻干品，规格有0.1ml/支和0.5ml/支二种。
1.3.4细菌内毒素工作标准品，由中国药品生物制品检定所指定的鲎试剂厂标定及供应。
1.3.5供试品溶液可按药典正文规定进行。
2.操作步骤：2.1取试管5支，各加入0.1ml鲎试剂溶液，其中2支分别加入0.1ml供试品溶液作为供试品管。
2.2另一支加入2倍灵敏度内毒素标准品溶液0.1ml作为阳性对照管。
2.3第四支加入2倍灵敏度内毒素标准品溶液0.1ml，再加入供试品溶液0.1ml 作为样品阳性对照管。
2.4最后一支加入0. 灵敏度1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
2.5将上述5支管轻轻混匀后封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴中保温60min ±2min，小心取出，观察结果。
3.结果判断3.1阳性：缓慢倒转试管180℃，管内物质是坚实凝胶者，记录为（+）3.2阴性：缓慢倒转试管180℃，管内物质流动或呈凝胶状但不能保持完整者，记录为（－）3.3阳性对照管2管均为阳性（+）及阴性对照管为阴性供试品（－），则试验有效。
3.4供试品2管均为阳性结果（+），应判为不符合规定。
如供试品2管均为阴性结果（－）则符合本法规定。
3.5供试品2管中如有一管为（+），一管为（－）时，按“2.操作步骤”另取4支试管复试，4管中如有一管（+），即认为该批样品不符合本法规定。
细菌内毒素检查法凝胶法
• 细菌内毒素的量用内毒素单位 （EU） 表示， 1EU 与 1 个内毒素国际单位 （IU）相当。
• 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制 而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标 定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检 查法中编号B 和 C 溶液的制备、 凝胶法中鲎试剂 灵敏度复核试验、 光度测定法中标准曲线可靠性 试验。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的 外源性内毒素。
• 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以 上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒 素检查的适宜方法。若使用塑料器具，如微孔 板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明 无内毒素并且对试验无干扰的器械。
供试品溶液的制备
• 某些供试品需进行复溶、 稀释或在水性溶 液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调 节被测溶液（或其稀释液）的 pH 值，一般 供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的 pH 值 在 ～8.0 的范围内为宜，可使用适宜的酸、
• 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准 品为基准标定其效价， 用于干扰试验及检查法中 编号 B 和 C 溶液的制备、 凝胶法中鲎试剂灵敏 度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
• 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准， 其内毒素含量小于（用于凝胶法）或 （用于 光度测定法） ，且对内毒素试验无干扰作用。
• 释倍数小于 MVD 而溶液 A 出现不符合规定时， 需将供试 品稀释至 MVD 重新实验，再对结果进行判断。
结束
• 谢谢大家，共同讨论吧。。。。。。
细菌内毒素检查法--凝胶法
• 利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产 生的细菌内毒素， 以判断供试品中细菌内 毒素的限量是否符合规定的一种方法。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害一、热原的性质及除去热原的方法1．高温法热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
隧道烘箱及干热烤箱除内毒素效果验证方法
隧道烘箱及干热烤箱除内毒素效果验证方法——湛江博康海洋生物有限公司质量管理部提供1. 概述:干热可用于能耐受较高温度，却不宜被蒸汽穿透，同时干热灭菌也是制药工业生产流程的包装材料及试验器材用于除热原的方法。
干热灭菌设备是隧道式和干热恒温箱的灭菌除热原系统。
隧道式灭菌除热原系统主要由加热器、高效过滤器、缓冲板、风阀气流调节器、风机、传送带、运行连锁控制系统、温度控制器及记录仪等7大部分组成。
干热恒温箱主要由加热器、风阀气流调节器、风机、温度控制器及隔板等5部分组成。
2. 验证目的:为了确认隧道式烘箱和干热恒温箱腔内不同位置的热分布情况，确认预定的灭菌、除热原程序能否达到预先设计要求。
特制订本验证方案，拟对该设备的除内毒素效果进行验证。
3. 验证范围:本验证方案适用于隧道式烘箱和干热恒温箱除内毒素的验证。
4. 验证内容:4.1空载热分布测试:检查灭菌腔内的热分布情况，调查灭菌腔内不同位置的偏差状况，确定可能存在的冷点。
测试程序:选择10个热电阻或热电偶作温度探头，编号后固定在输送带上的不同位置(一般10-15cm设一个温度探头)。
电偶焊接的尖端不能与输送带表面接触。
记录探头位置。
温度探头分布图见下图。
设备按实际生产运行条件操作，记录腔内温度变化。
空载热分布测试应至少进行3次重复性试验以证明热分布的重现性，若在试验过程中发现温度分布不符合设定要求，则应调整温度调节器进风、回风及循环风档板，改善空气流动状态等。
图. 空载热分布温度探头分布图。
评价标准:设备在空载状态下热分布应均匀，腔室内各点的温度值与设定值之间的偏差不得超过?5?。
4.2装载热穿透试验:进行装载热穿透试验的目的是在热分布试验的基础上，确定装载中的最冷点，并确认该点在灭菌设定时间内能够获得充分的灭菌保证值。
装载确定:满载或日常工作状态下。
装载类型:按实际情况填写灭菌程序:350?×6min温度探头安装:温度探头应安装于待灭菌的物品中间部位，并使其与物品表面接触。
内毒素检查法凝胶法工艺流程
内毒素检查法凝胶法工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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细菌内毒素检查法
85细菌内毒素检查法u s p37(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--<85>细菌内毒素试验USP37装置将用于验证过程的所有玻璃器皿和热稳定性材料置于干热灭菌箱中以除去热原。
最小灭菌时间和温度一般为30min,250°。
若需使用塑料器皿，例如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械。
【注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微量滴定管】试剂及试液阿米巴溶解产物（鲎试剂）——鲎试剂是一种由寄生于鲎（中国鲎或美洲鲎）中的阿米巴虫的溶解产物（白血细胞）获得的冻干产品。
该试剂符合有关法规要求。
【注：鲎试剂会对一些除内毒素外的β-葡葡聚糖起反应。
可利用鲎试剂不与葡聚糖反应，通过移除阿米巴溶解产物中会与葡聚糖反应的G因子或抑制阿米巴溶解产物的G因子反应系统和用于存在葡聚糖的内毒素试验。
】细菌内毒素检查用水（BET）——用注射用水或其他不与鲎试剂反应的在灵敏限度内的水。
溶菌液供试液——在缓慢搅拌下，阿米巴溶解产物（鲎试剂）溶于BET检查用水或鲎试剂生产商建议的缓冲液中，根据生产需要贮存重组的鲎试剂，冷藏或冷冻。
溶液的制备：标准内毒素储备液——标准内毒素储备液是根据包装上的说明书，制剂标签上标准内毒素储备液的储存和制备，用现行的WHO国际标准校准过的USP内毒素标准品制备的。
内毒素用EU表示。
【注：1EU=1IU】内毒素标准液——将内毒素储备液混合均匀，再用细菌内毒素检查用水对其作适当的系列稀释。
尽快使用稀释液，以避免因吸附而失去活性。
供试液——供试溶液是通过用细菌内毒素检查用水溶解、稀释药物制备。
某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释。
如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。
通常使用于pH范围在的产品。
pH的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。
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去内毒素的方法及检查方法
注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害
一、热原的性质及除去热原的方法
1．高温法
热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法
热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法
热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法
热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法
热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它
包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法
《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。
家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用
于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
2．细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏1 0倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法
内毒素在体外的减毒在体外有多种理化和生物学方法可以使内毒素的毒性减低，这些方法可用来研究内毒素毒性的化学结构基础，或用于消除某些制剂的致热原（即内毒素）污染，或用以制备防治用的免疫制剂等。
（1）物理方法：紫外线、射线、超声波等可使内毒素毒性降低。
Fust 等（1977）报导，内毒素经γ射线照射后，其对小白鼠致死性、狗体内降压作用以及抗补体等活性降低，且其程度与射线照射剂量成正比。
经照射的脂多糖激活补体经典途径的能力减低，如经验
0megarads照射的脂多糖，激活补体几乎全通过替代途径。
如前所述，经典途径由类脂A激发，可见照射主要作用于类脂A。
Nerdar 等（1977）指出经照射类脂A中的β羟经肉豆蔻酸即消失，且认为照射可使内毒素变为类毒素。
Szilsgyi(1978)通过家兔实验比较，提出大肠杆菌内毒素经60Co电离照射后，引致白细胞和血小板减少及局部Shwartzman反应的能力均明显减低，而对纤维蛋白原和补体的影响较小。
（2）化学方法：用化学药品使内毒素减毒。
所用化学药品种类繁多，其机制有酸或硷的水解作用、酰化作用、脱酰化作用，转酯化作用、羟胺解作用以及氢化铝锂（LiAIH4）的还原作用等，上述作用主要影响内毒素类脂A的脂肪酸部分，如L iAIH4，使酯键断裂，经NaOH 处理，使内毒素脂肪酸皂化，发生分子的化学构型改变而减毒。
若再加入95%乙醇或80%二甲基亚砜可加速其皂化，故用0.03N NaOH 的95%乙醇处理葡聚糖凝胶，以去除污染的致热原，效果很好。
（3）生物学方法：业已证实多粘菌素B具有使内毒素减毒的功能。
多粘菌素B的阳离子氨基与内毒素类脂A的带负电荷的磷酸根结合，使内毒素失却多种生物学活性（包括致死性、致热性、抗补体的经典
途径、促分裂活性、激发单核细胞产生组织因子、对白细胞、血小板和巨噬细胞的激发作用以及对鲎珠溶解物的凝固能力等等）。
因此认为多粘菌素B为类脂A的抑制剂。
Craig等（1974）在实验狗体内证实多粘菌素B有抗脂多糖的活性，然而必须使用高毒性剂量，以致临术应用极为困难。
Corrigan等（1979）以出血败血性巴斯德菌造成家兔的内毒素血症的前或后给予多粘菌素B，均可减低血液中内毒素量，从而提高实验动物的存活率。
由于抗菌素中和毒素的作用与其抗菌作用互不相关，且该菌对多粘菌素B的抗菌作用不敏感，故实验动物经用多粘菌素B处理后，血培养仍为阳性。
人体革兰氏阴性菌感染的临床症状主要由内毒素血症所引起，因此着重研究体内内毒素的中和作用具有实用意义。