维生素E检测方法研究

液相色谱法检测的生育酚方法报告

一、生育酚简介

又称维生素E，是一种脂溶性维生素，是最主要的抗氧化剂之一。溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感。

维生素E为微带粘性的淡黄色油状物，在无氧条件下较为稳定，甚至加热至200℃以上也不被破坏。但在空气中维生素E极易被氧化，颜色变深。维生素E易于氧化，故能保护其他易被氧化的物质（如维生素A及不饱和脂肪酸等）不被破坏。

维生素E的化学名称为(1)-2、5、7、8-四甲基2-(-4、8、12-三甲基十三烷基)-6-苯并二氢吡喃醇醋酸酯，分子式为C31H52O3，结构式为：

根据其化学结构可分为生育酚及生育三烯酚两类。生育酚主要有四种衍生物，按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。其中，α-生育酚：R1，R2=CH3；β-生育酚：R1=H，R2=CH3；γ-生育酚：R1=CH3，R2=H；δ-生育酚：R1，R2=H。维生素E以α-生育酚生理活性最高，β-及γ-生育酚仅为α-生育酚的40%和8%。

二、色谱方法的选择

现行标准中维生素E的检测仅有两个标准——《食品中维生素A和维生素E的测定》（GB/T 5009.82-2003）和《食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》（NY/T 1598-2008），其中前者介绍了液相色谱法和比色法两种方法。

目前有的文献[1]中指出，气相色谱法虽能正确定量维生素E，但是对不同型分离困难，为了使α-维生素E与β-维生素E及γ-维生素E分离，预先要将试样进行三甲基硅烷化或酯化，同时胆同醇等硬脂类对测定有干扰。另外，如果前期样品处理不好，很容易对毛细管柱造成污染。故建议使用液相色谱法。

三、内标法和外标法的选择

1、两种方法的区别：

内标法外标法内标物与待测物相似，且均出峰不需要

标准曲线需要，可两点需要，需多点

优点定量准确操作简便

缺点不容易选择内标物；操作精度高与标准品严格相同的操作条件

2、在《食品中维生素A和维生素E的测定》中采用了内标法，内标物为苯并[a]芘，另外

文献中也有使用正三十二烷及十六酸十六醇酯等。《食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》中使用的外标法，国内大多数检测维生素E的文献中都用的是外标法。根据我部门的实际情况，维生素E的检测一般用于豆油脂肪酸的日常检测和协助营销部门的发货定价，故精度要求不是非常高，而内标法每次检测需用到内标物，而内标物的成本通常偏高，因此，外标法可以满足我部门日常检测的需求。

3、外标曲线

有文献报道[2]，随着甲醇浓度的升高，α-维生素E峰形越尖锐，100％甲醇和98：2流动相得到谱图相似，并能与其它杂质峰很好地分离。这是因为对反相柱来说，甲醇是强洗脱剂，其含量越高，流动相的极性越小，洗脱能力越强，α-维生素E越易被洗脱，而其它杂质却被保留；随着水含量的增加，流动相极性增强，对α-维生素E洗脱能力减弱。综合考虑，最终选择98：2的甲醇为流动相。

柱温对保留时间是有影响的，柱温升高，保留时间会减小，对定性造成影响，因此必须设定柱温。

紫外检测器波长一般在290-296nm之间选择。

有文献[3]称，β-维生素E的峰被γ-维生素E峰掩盖，而通过检测，也证实是这样的。因此，利用现有的α-、γ-、δ-维生素E标准品配制成六个浓度点，绘制标准曲线，各曲线拟合度均在0.9999以上。

（1）色谱条件

流动相：甲醇+水（V/V）=98+2，混匀，临用前脱气。

柱温：30℃。

色谱柱：Eclipse XDB-C18反相柱，4.6×150mm。

检测波长：294nm。

进样量：10μL

（2）α-维生素E

四、 样品前期处理的选择

目前，国内和AOCS 方法中对维生素E 检测的前期处理均用到皂化法，上述两标准中的方法也均为皂化法。但已有一些文献[2]中出现了超声波法，该方法简单易行，节省溶剂，减少损失。我们对两种方法进行几组对比实验。实验发现，超声波提取法几乎对维生素E 没有损失，而皂化法由于步骤繁多，且维生素E 活性高，出现了一定量的损失。

本实验中，超声波法：取1g 样品于50mL 容量瓶中，加30mL 左右无水乙醇，超声震

荡15min 后，稀释至刻度，注入10μL 于液相色谱分析。计算公式为：

%10010

1000150)/(%⨯⨯⨯⨯=

g mL

mL g C VE μ

皂化法：取1g 样品于皂化瓶中，加入30mL 无水乙醇溶解，加入5mL 抗坏血酸（100g/L ），加入20mLKOH 溶液（1g/L ），加热回流30min 后，冷却，倒入分液漏斗，先后用50mL 蒸馏水50mL 乙醚洗皂化瓶，并入分液漏斗，洗三次，收集乙醚相过无水硫酸钠于100mL 容量瓶中，稀释至刻度，取10mL 与烧瓶中，于烘箱中蒸干乙醚，用1mL 无水乙醇溶解，注入10μL 于液相色谱。计算公式为：

%10010

10001110)/(%⨯⨯⨯⨯⨯=

g mL

mL g C VE μ

其中，C 为色谱图中直接读出的含量。

五、

实验结果与讨论

保留时间的差别：同一色谱条件下，皂化法的保留时间基本上比超声波法的保留时间稍长，但差别不大，可以看做基本相同。

维生素E含量的差别：两方法检测所得VE含量差别较大。对豆油脂肪酸来说，这是我们需要日常检测的样品，也涉及到我公司销售定价的检测项目，由于皂化法前处理经过加热、洗涤、蒸干等多个步骤，其损失量在15-25%范围内，而客户与国标均采用了此方法，故在日常维生素E的检测中，为了保持一致，建议使用皂化法处理样品，进行检测。对于棕榈油脂肪酸，其出峰多而杂，保留时间普遍增大，超声波法检测出的结果也偏低，可以初步判定其本身维生素E含量较低。值得注意的是，超声波法可检测出棕榈油脂肪酸中γ-VE的含量，而皂化法并未检测出，这也证明了超声波法比皂化法损失小的优点。对于低维生素E 含量的样品，影响波动增大，皂化法检测含量损失在30-50%。见表1。

对于大豆油和棕榈油，保留时间比脂肪酸大，峰形多而杂。其维生素E含量很低，皂化法比超声波法损失均超过50%。见表2。另外，处理棕榈油样品时，由于棕榈油不易溶于无水乙醇，因此处理上极为困难，这也是需要改进溶剂的一个方面。

表2 植物油中维生素E检测结果的对比

六、关于回收率实验

本实验对α-、γ-、δ-维生素E分别进行了回收率的空白实验，以验证皂化法的回收率。即取已知含量的三种维生素E分别进行皂化法处理，得到回收率分别为：71.3%、11.8%、

58.7%。这也说明了皂化法存在着一定的损失。γ-维生素E有待再次验证。

七、结论

对于维生素E检测方法来说，超声波法处理方便，检测快速，损失小，是一种理想的检测维生素E含量的方法。但对于日常检测及销售上，为了与客户及第三方检测一致，避免纠纷，我们建议采用国标中的皂化法来进行检测。