蛋白质的测定方法

蛋白质的测量方法

食品11—2 阚黎娜110424221 方法一凯氏定氮法

原理：蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游

离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘

以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量。

优势：①可用于所有食品的蛋白质分析中；

②操作相对比较简单；

③实验费用较低；

④结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；

⑤用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：①最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；

②实验时间太长(至少需要2h才能完成)；

③精度差，精度低于双缩脲法；

④所用试剂有腐蚀性。

适用范围：针对有机氮化合物,主要是指蛋白质,aa,核酸,尿素以及大量合成的氮为负三价的有机氮化合物.它不包括叠氮化合物,联氮,偶氮,腙,硝酸盐,亚

硝酸盐,硝基,腈,肟和半卡巴腙类的含氮化合物。

分析：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态

的氮含量。凯氏定氮法通过测定氮的含量来代表蛋白质的含量的方法

给了很多不法商贩可乘之机。才造成了“三鹿”三聚氰胺等事件的发

生。但凯氏定氮依赖它的准确，范围广等优点，还是一种经典的测定

方法。

方法二双缩脲法

原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色

络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，

或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫

色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基

酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

优势: ①较快速；

②不同的蛋白质产生颜色的深浅相近；

③干扰物质少

缺点：灵敏度差。

适用范围：测定范围为1~10mg蛋白质。

分析：双缩脲法虽然速度快，但它的灵敏度较差，故双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

方法三紫外吸收法

原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度(即

光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收

值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋

白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

优势：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差

②干扰物质多

③在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨和

氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。

适用范围：该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

分析：若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的

校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经

过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测

定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶

液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。低浓

度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰

测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定

蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

方法四酚试剂法

原理：此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这

两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键

与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白

质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合

物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

优势：①较双缩脲法反应灵敏；

②与0.1mg/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应

③使用很广泛。

缺点：①花费时间长;

②其干扰因素较多。

适用范围：适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量，可测定范围是25—250μg蛋白

质。

分析：这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮蓝法

所取代。最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生

物化学领域得到广泛的应用。

方法五考马斯亮蓝法

原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；

当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有

最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的

定量测定。

优势：①灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－

染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比

Lowry法要大的多。

②测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要

5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完

成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜

色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时

间。

③干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、

糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

缺点： ①由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时

通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

②仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton

X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干

扰Lowary法一样）。

③标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只

能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

适用范围：用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。

分析：考马斯亮蓝测定蛋白质浓度是较常用的方法，误差可尽量减到最小，需注意：测定OD值前，将分光光度计提前预热至少30分钟，可保证

准确性；配制好的考马斯亮蓝溶液应放于4度保存备用；盐离子不会

影响实验结果，但去污剂，如TRITON X-100，SDS等，会严重干扰

实验结果。

总结

除以上几种方法外，还有自动定氮分析法等多种测量方法，都各有优